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细胞信号转导与有机磷迟发性神经病变的关系研究

作　者: 傅真真
导　师: 刘毅
学　校: 山东省医学科学院
专　业: 劳动卫生与环境卫生学
关键词: 甲胺磷磷酸三甲苯酯有机磷诱发的迟发性神经病神经病靶酯酶蛋白激酶A 蛋白激酶C 微管相关蛋白2
分类号: R114
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

【目的】分别以甲胺磷和磷酸三甲苯酯诱发母鸡迟发性神经病(OPIDN),观察病理学改变及超微结构的变化,测定神经病靶酯酶的改变及有关生化指标的变化,检测大脑信号转导途径中蛋白激酶C、蛋白激酶A以及微管相关蛋白2和β-actin的动态变化趋势,阐明甲胺磷和磷酸三甲苯酯诱发OPIDN过程中不同信号蛋白含量水平的改变,为进一步探讨细胞信号转导途径在OPIDN发生中的作用机制提供依据。【方法】健康成年母鸡(鲁禽种鸡)44只,适应性喂养1周后,将动物按体重随机分为甲胺磷造模组(n=20),磷酸三甲苯酯造模组(n=20)和对照组(n=4)。甲胺磷造模组经口给予甲胺磷10mg/(kg·d),连续给药14天;磷酸三甲苯酯造模组经口给予磷酸三甲苯酯原油1ml/(kg·d),连续给药7天,诱发迟发性神经毒性。对照组动物连续14天经口给予生理盐水1ml/(kg·d)。甲胺磷组、磷酸三甲苯酯组和对照组母鸡于染毒后7d、14d、21d、28d断头处死,取血清备用。迅速取出脑、脊髓、坐骨神经和腓肠肌,按照常规要求制备病理及电镜标本。动物血清中的谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和碱性磷酸酶(ALP)的含量采用试剂盒进行测定,采用自动生化仪测定胆碱酯酶(CHE)、钙(Ca)的含量。神经病靶酯酶(NTE)活性的测定采用经典的酶抑制差异测定法。采用Western blotting检测了大脑中蛋白激酶C、蛋白激酶A以及微管相关蛋白2和β-actin的动态变化趋势。【结果】1. OPIDN动物模型的建立和病理观察本实验中甲胺磷组经口小剂量(10mg/kg)多次累计染毒至5倍LD50以上,60%可出现OPIDN的典型症状,染毒后急性症状表现重,但是不给予保护剂,仍可度过急性期。磷酸三甲苯酯造模组的动物,染毒后急性症状轻,进食尚可,连续7天给予原油1ml/(kg·d),停药后7-10天全部出现典型的OPIDN。甲胺磷诱导的OPIDN母鸡神经组织在出现OPIDN症状21d时可见到轴浆内结构融解现象,髓鞘成气泡样变,髓鞘的损伤变化随时间的延长也逐渐加重, 28d时可见多处板层松散、破裂甚至崩解。同时观察到磷酸三甲苯酯诱导的OPIDN母鸡神经组织也呈现类似改变,这些变化也与临床表现相一致。2.动物血清中生化指标的测定甲胺磷组动物血清谷丙转氨酶(ALT)的含量在染毒结束后的7d、14d、21d均显著高于对照组(P<0.05),磷酸三甲苯酯组在染毒结束后的7d和14d均显著高于对照组(P<0.01)。磷酸三甲苯酯组动物血清谷草转氨酶(AST)的含量在染毒结束后的14d至28d均显著高于对照组(P<0.05)。甲胺磷组和磷酸三甲苯酯组动物血清胆碱酯酶(CHE)的含量在7d、14d、21d和28d均显著低于对照组(P<0.05)。甲胺磷组动物血清钙的含量在染毒结束后的21d、28d均显著高于对照组(P<0.05),磷酸三甲苯酯组在染毒结束后的7d显著高于对照组(P<0.05)。3.神经病靶酯酶(NTE)活性的测定甲胺磷组和磷酸三甲苯酯组动物神经病靶酯酶(NTE)的活性在染毒结束后的7d、14d、21d、28d均显著低于对照组(P<0.01)。4. OPIDN动物大脑中蛋白激酶、β-actin、微管相关蛋白2含量的变化甲胺磷组动物大脑中蛋白激酶C(PKC)含量在染毒结束后的7d、14d、21d、28d分别降低了24%(P<0.05)、28%(P<0.05)、30%(P<0.05)、62%(P<0.01),磷酸三甲苯酯组在染毒结束后的7d、14d、21d、28d分别降低了64%(P<0.01)、58%(P<0.01)、58%(P<0.01)、43%(P<0.05)。甲胺磷组和磷酸三甲苯酯组动物大脑中蛋白激酶A(PKA)的含量与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组相比,甲胺磷组动物大脑中β-actin含量在染毒结束后的14d升高了30%(P<0.05),磷酸三甲苯酯组的动物在染毒后的第7d降低了26%(P<0.01)。甲胺磷组动物大脑中微管相关蛋白2(MAP-2)含量在染毒结束后的14d、28d均显著高于对照组(P<0.01),磷酸三甲苯酯组在染毒结束后的7d、14d、21d均显著高于对照组(P<0.01)。【结论】1.工业用磷酸三甲苯酯可建立鸡迟发性神经病(OPIDN)的良好动物模型,甲胺磷经口小剂量多次染毒可建立OPIDN动物模型,在未给予保护剂的情况下,造模的成功率较以往有很大提高。两组动物的神经组织均出现脱髓鞘等明显的神经损害。2. OPIDN发生并进展时,钙离子含量的显著改变,提示钙离子的含量变化与OPIDN的发生有相关关系。3.沿用经典的方法对NTE的抑制进行监测,NTE在OPIDN进展中被明显抑制,但其检测还存在底物稳定性不佳等局限性。4. Western blotting方法在大脑未发现PKA含量的改变,在今后的试验中应当对其他的神经组织进行进一步的研究。PKC含量的降低出现在OPIDN的进行阶段,可以考虑其是否可作为OPIDN发生发展的生物标志物。甲胺磷和磷酸三甲苯酯对蛋白的影响表现有差异性,对MAP-2和PKC含量的改变明显显著于β-actin。动物大脑中MAP-2含量的明显改变提示微管的结构和功能受到影响。

全文目录

中文摘要  5-8
英文摘要  8-12
主要符号表  12-13
前言  13-16
材料和方法  16-27
结果  27-39
讨论  39-50
结论  50-51
参考文献  51-58
综述  58-65
攻读期间已(待)发表文章  65-66
致谢  66

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