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辣椒素抑制大鼠感觉神经元电压门控性钙通道的细胞信号转导途径

作　者: 刘悦雁
导　师: 孔德虎；王烈成
学　校: 安徽医科大学
专　业: 生理学
关键词: 辣椒素辣椒素受体背根神经节电压门控性钙通道蛋白激酶C
分类号: R33
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

目的由电压门控性钙通道(voltage-activated calcium channels, VACCs)进入细胞的Ca2+在神经元信息传递过程中起重要作用,有研究表明,辣椒素能抑制VACCs,并使伤害性感受器脱敏。本研究应用膜片钳和钙离子成像技术研究辣椒素(capsaicin, Cap)对急性分离的大鼠背根神经节(dorsal root ganglion, DRG)神经元的VACCs的抑制效应并探讨其细胞信号的转导途径。方法1. DRG神经元的分离雄性SD大鼠,体重80 - 120 g,清洁级。断头处死,取胸段脊柱,置于混合气(95%O2 + 5%CO2)饱和的0℃的DMEM液中,暴露椎管,分离DRG,并随即将其置于含胰蛋白酶(0.5 mg/ml, I型)和胶原酶(1 mg/ml, IA型)的DMEM液中,在恒温水浴(37℃)中消化30分钟。消化完毕,用DMEM液反复清洗四次,然后用不同口径的吸管吹打,使DRG神经元分散成单个细胞形成细胞悬液,用吸管吸取细胞悬液滴在小玻片上静置30分钟,待细胞贴壁后加细胞外液于培养皿中,细胞在10小时内可用于实验。2.钙离子成像钙离子成像技术可监测细胞内Ca2+浓度([Ca2+]i)的变化。[Ca2+]i的测量采用一种Ca2+敏感性的荧光染料Fura-2 acetoxymethyl ester (Fura-2/AM)。在37°C用含有2μmol/L的Fura-2/AM的外液孵育DRG神经元,结合Ca2+的Fura-2/AM的激发光波长是340 nm,未结合Ca2+的Fura-2/AM的激发光波长是380 nm,发射波长均为510 nm。这样就可以用340 nm和380 nm这两个荧光的比值定量[Ca2+]i的变化。利用钙离子成像分析软件TILLvision软件,可实时检测[Ca2+]i的变化。3.全细胞膜片钳记录VACC电流以及辣椒素诱导的电流通过膜片钳技术记录。钳制电极由微电极拉制仪拉制而成,然后经抛光仪对电极尖端抛光。在电极充灌内液后,使电极尖端的入水电阻为3至5 m?。使电极与细胞膜达到髙阻抗(G?)封接,然后将电极尖端钳制的膜吸破,则全细胞模式建立。将膜电位钳制在?70 mV,在200 ms的时间去极化至0 mV,给予神经元这样的去极化脉冲可诱发VACC电流。用辣椒素(1μmol/L)灌流神经元,通过观测是否有内向电流出现来检测DRG神经元对辣椒素的敏感性。整个实验过程在室温下进行。4.统计学分析采用Igor Pro软件进行统计分析。统计数据用均数±标准误(mean±SEM)表示,组间均数比较用非配对t检验,p < 0.05认为差异有显著性。结果1.在辣椒素敏感性的DRG神经元,辣椒素(1μmol/L)能诱发内向电流,并且辣椒素对VACC电流具有明显的抑制效应。而在辣椒素不敏感性的DRG神经元,检测不到由辣椒素诱发的电流,也观察不到辣椒素对VACC电流的抑制效应。2.高钾(40 mmol/L)通过激活VACC使[Ca2+]i升高。在辣椒素敏感性的DRG神经元,辣椒素(1μmol/L)使[Ca2+]i升高,则高钾使[Ca2+]i升高的效应几乎被辣椒素完全抑制。而在辣椒素不敏感性的DRG神经元,辣椒素不能使[Ca2+]i显著升高,则高钾使[Ca2+]i升高的效应不受辣椒素的影响。3.辣椒素抑制高钾诱导的电压门控性Ca2+内流的效应可被蛋白激酶C(PKC)选择性抑制剂Bisindolylmaleimide显著减弱。结论在辣椒素敏感性的DRG神经元,辣椒素能够抑制VACCs,这种抑制效应依赖于胞内钙信号且受PKC的调控。

全文目录

英文缩略词表  5-6
中文摘要  6-8
英文摘要  8-11
前言  11-13
材料与方法  13-17
结果  17-25
讨论  25-28
结论  28-29
参考文献  29-36
附录  36-37
致谢  37-38
文献综述  38-51

辣椒素抑制大鼠感觉神经元电压门控性钙通道的细胞信号转导途径

内容摘要

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