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青蒿素类抗疟药与药物代谢酶相互作用研究

作　者: 孙坤
导　师: 张淑秋
学　校: 山西医科大学
专　业: 药剂学
关键词: 青蒿素双氢青蒿素药物代谢酶荧光光谱法实时荧光定量PCR
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的:青蒿素类抗疟药是一类具有内过氧桥结构的倍半萜内酯类化合物。已有研究表明青蒿素口服吸收迅速但不完全,多剂量给药后的血药浓度-时间曲线下面积明显降低,具有自身诱导代谢现象。青蒿素类药物自身诱导代谢现象主要与CYP2B6 （cytochrome P450, family 2, subfamily B, polypeptide 6）有关,在该酶缺乏的情况下,CYP3A4 （cytochrome P450, family 3, subfamily A, polypeptide 4）也起次要代谢作用,且该类药物还能诱导CYP2C19 （cytochrome P450, family 2, subfamily C, polypeptide 19）。有研究表明孤儿核受体孕烷X受体（pregnane X receptor, PXR）及组成型雄烷受体（conatitutive androstane receptor, CAR）是介导CYP450s诱导的关键调控因子。青蒿素类药物对CYP450s的诱导是否通过激活PXR或者CAR,目前尚不清楚。本实验拟从药物分布及代谢角度,采用荧光光谱法及同步荧光光谱法,以青蒿素类抗疟药的母体药物青蒿素（artemisinin, ART）及该类衍生物共有的活性代谢产物双氢青蒿素（dihydroartemisinin, DHA）为代表药物,以牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）、人血清白蛋白（human serum albumin, HSA）、大鼠肝微粒体（rat liver microsomes, RLM）、人肝微粒体（human liver microsomes, HLM）、重组药物代谢酶CYP2B6, CYP2C19, CYP3A4等为研究蛋白,从基础层面研究代表药物与蛋白的结合作用;并且进一步采用实时荧光定量PCR分析方法,考察青蒿素类药物多剂量口服和静脉注射给药诱导对大鼠小肠中PXR, CAR及CYP2B, CYP3A, CYP2C同工酶的mRNA水平的影响,据此探讨青蒿素类抗疟药对大鼠小肠CYP450s的诱导代谢机制。方法:（1）荧光光谱法研究青蒿素类药物与药物代谢酶相互作用。分别固定BSA, HSA, RLM, HLM, CYP2B6, CYP2C19及CYP3A4的浓度,逐渐加入一定体积的ART或DHA溶液,扫描其荧光光谱及同步荧光光谱。根据Stern - Volmer方程、结合常数表达式、热力学方程,计算得到结合参数和热力学参数,判断各反应体系的荧光猝灭机制、反应类型、主要作用力类型,以及药物对作用蛋白构象的影响。（2） PCR技术研究青蒿素类药物对大鼠小肠核受体及CYP450s mRNA水平的影响。SD大鼠随机分八组,分别进行如下处理:ART口服多剂量诱导组:80 mg/kg/d;DHA口服多剂量诱导组:10 mg/kg/d;口服溶剂对照组:每天灌胃等体积食用油;ART静注多剂量诱导组:16 mg/kg/d;DHA静注多剂量诱导组:5 mg/kg/d;ART静注溶剂对照组:每天静注等体积50%乙腈;DHA静注溶剂对照组:每天静注等体积50%乙醇;完全空白组。均连续给药5天,末次给药24h后处死大鼠,取出小肠。将小肠组织经过Trizol一步法提取总RNA。采用实时荧光定量PCR法检测PXR, CAR, CYP2B1, CYP2C6及CYP3A1 mRNA水平,采用2^-ΔΔCt法计算相对定量结果,SPSS软件进行统计分析。结果:（1） ART或DHA与BSA和HSA的相互作用作用均为静态猝灭,生理体温310 K时的结合常数分别为5.54×10³, 7.31×10², 1.18×10³, 2.57×10³ L·mol^-1,均为自发的热力学反应、作用力以氢键和范德华力为主,ART和DHA均改变了BSA及HSA的构象。（2） ART或DHA与RLM的相互作用均为静态猝灭,生理体温310 K时的结合常数分别为1.90×10⁴, 4.07×10¹ L·mol^-1; ART, DHA与HLM作用均以静态猝灭为主,生理体温310 K时,ART与HLM的结合常数在ART浓度≤10.88 10^-6 mol·L^-1和ART浓度≥10.88 10^-6 mol·L^-1时,分别为1.05×10⁴ L·mol^-1和1.55×10⁵ L·mol^-1;DHA与HLM的结合常数为1.34×10³ L·mol^-1;这四种反应系统均为自发的热力学反应、作用力以氢键和范德华力为主。（3） ART和DHA对CYP2B6的猝灭机制以静态猝灭为主,温度升高时则为静态猝灭和动态猝灭共同作用的混合猝灭机制;在生理体温条件下DHA对CYP2B6的结合能力强于ART;当温度范围由296K 303K上升到303K 310K,ART - CYP2B6系统的主要结合力由氢键和范德华力转变为疏水作用力,而DHA - CYP2B6系统则由静电引力转变为氢键和范德华力;均为自发的热力学反应;在同一温度下DHA与ART对CYP2B6的构象无影响。（4） ART或DHA与CYP2C19和CYP3A4的相互作用均为静态猝灭,生理体温310 K时的结合常数分别为4.76×10¹, 2.43×10³, 6.55×10², 5.46×10³ L·mol^-1;这几个反应均为自发的热力学反应,并且主要结合作用力均为氢键和范德华力;CYP2C19及CYP3A4的同步荧光光谱则得出随着药物ART和DHA的不断加入,色氨酸残基周围微环境亲水化,而酪氨酸残基周围微环境则发生疏水化。（5） mRNA的测定:相比对照组及相应的溶剂对照组,多剂量口服诱导组和静注诱导组的PXR, CAR, CYP2B6, CYP2C19, CYP3A4 mRNA水平均无显著差异（P>0.05）。结论:ART和DHA均和BSA, HSA, RLM, HLM, CYP2B6, CYP2C19和CYP3A4有结合作用,且这两种药物分别对这七种蛋白产生的结合作用程度不同,作用力类型不尽相同,对蛋白的空间构象影响也不同,具有种属间差异;实时荧光定量PCR实验则表明,ART以及DHA对大鼠小肠中的核受体PXR和CAR,以及CYP2B1, CYP2C6, CYP3A1 mRNA水平没有上调作用,青蒿素类抗疟药的自身诱导代谢是否与小肠首过代谢有关需进行进一步实验验证。

全文目录

中文摘要  5-7
英文摘要  7-10
前言  10-13
第一章青蒿素类抗疟药与血清白蛋白的相互作用  13-26
  1.1 青蒿素类抗疟药与BSA 相互作用  13-20
  1.2 青蒿素类抗疟药与HSA 相互作用  20-26
第二章青蒿素类抗疟药与肝微粒体的相互作用  26-36
  2.1 青蒿素类抗疟药与大鼠肝微粒体的相互作用  26-30
  2.2 青蒿素类抗疟药与人肝微粒体的相互作用  30-36
第三章青蒿素类抗疟药与药物代谢酶相互作用  36-52
  3.1 青蒿素类抗疟药与CYP2B6 的相互作用  36-41
  3.2 青蒿素类抗疟药与CYP2C19 的相互作用  41-46
  3.3 青蒿素类抗疟药与CYP3A4 的相互作用  46-52
第四章青蒿素类抗疟药对大鼠小肠内核受体和 CYP450s mRNA 表达水平的影响  52-61
  4.1 青蒿素类抗疟药对大鼠小肠内核受体mRNA 表达水平的影响  52-57
  4.2 青蒿素类抗疟药对大鼠小肠内CYP450s mRNA 表达水平的影响  57-61
参考文献  61-65
个人简介  65-66
致谢  66

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