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慢病毒介导Bcl-2基因在大鼠体内的表达及对化疗后卵巢功能影响的动物实验研究

作　者: 晏三华
导　师: 何援利
学　校: 南方医科大学
专　业: 妇产科学
关键词: 慢病毒载体基因治疗卵巢功能早衰环磷酰胺卵巢大鼠
分类号: R711.75
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

研究背景卵巢早衰（Premature Ovarian Failure,POF）,又称绝经综合征,主要为40岁前卵巢功能停止活动。近年来POF的发病率逐年增高,临床上给患者外源性补充性激素可改善部分患者雌激素低下的症状,防治骨质疏松,提高生活质量,但因有一定副作用,长期服用令患者的接受性及依从性差,且不能解决POF导致的无排卵性不孕问题,因此有必要对其进行深入的研究。POF系由多种病因所致的卵巢功能过早衰竭,多发生于40岁以下妇女。临床表现为原发性或继发性闭经,以血清中促卵泡生成激素（FSH）水平上升＞40IU/L和雌二醇（E₂）水平下降＜25 pg/mL为特征,并有不同程度的一系列低雌激素症状,如:潮热、多汗、面部潮红、性欲低下等。1984年Tsujimoto等从与滤泡性淋巴细胞瘤相关的t（14;18）染色体易位的断裂点克隆到一种抗凋亡基因,命名为Bcl-2（B-cell lymphoma 2）基因。Bcl-2基因编码一个25-26KD的蛋白,其C端的21个疏水氨基酸组成一个延伸的链状结构。这个链可以插到细胞的膜结构中,这一结构特点与Bcl-2调节细胞凋亡的方式和能力非常有关。已经证实Bcl-2存在于线粒体外膜、核膜和内质网膜上。根据对Bcl-2家族成员蛋白的结构研究,发现其共同点是在蛋白链上都存在三个结构基序,分别称为BH1、BH2和BH3结构域。慢病毒（Ientivirus）载体是以HIV-I（人类免疫缺陷Ⅰ型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。它能相对定点整合到染色体的特定位置,在分裂和非分裂细胞中都能高效表达。研究表明,以HIV-I为基础构建的这类慢病毒载体具有可感染非分裂细胞、目的基因整合至靶细胞基因组长期表达、免疫反应小等优点,适于体内基因治疗。在用HIV-I载体已经进行的所有体内外实验中,未出现过有复制力的HIV,说明其安全性是有保证的。绿色荧光蛋白（Green Fluorscent Protein,GFP）是从水母中分离获得的一种发光蛋白,最早由Shimomura和Johnson等从水螅、水母类动物Aequorea Victoria中分离、纯化。这种蛋白由GFP基因编码,在蓝色激发光下可产生绿色或黄绿色荧光,经荧光显微镜、荧光激活细胞分拣器即可检测到。GFP检测时不需要添加任何底物或辅助因子,检测方便,检测灵敏度高;荧光稳定,荧光保持时间长;不干扰正常卵巢的结构和功能。增强型绿色荧光蛋白（Enhanced GreenFluorscent Protein,EGFP）是GFP的一个突变体;64位点的Phe→Leu,65位点的Ser→Thr,发射出的荧光强度比GFP大6倍以上。因此,比GFP更适合作为一种报告基因来研究基因表达、调控、细胞分化及蛋白质在生物体定位和转运等。近年来有研究者在卵巢组织检测到B细胞淋巴瘤（Bcl）-2基因,能诱导颗粒细胞分泌Bcl-2蛋白,以自分泌/旁分泌的方式调节颗粒细胞及卵母细胞的增殖分化,是卵泡持续发育所必须的调控蛋白。因此,本课题拟通过研究慢病毒介导Bcl-2基因在大鼠体内的表达及对化疗后卵巢功能的影响,以确定对化疗后卵巢功能是否有一定的改善作用。研究目的本研究通过探索慢病毒介导Bcl-2基因在大鼠体内的表达和通过腹腔注射环磷酰胺（cyclophosphamide,CTX）建立化疗性卵巢衰竭动物模型,将Bcl-2基因通过携带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的慢病毒载体介导,注射至双侧卵巢部位,检测卵巢颗粒细胞凋亡,观察卵巢结构及功能变化情况,探索慢病毒介导Bcl-2基因治疗化疗所致卵巢损伤的可行性及疗效,为临床上延缓女性生理机能衰老、治疗因化疗引起的不育或过早停经进行实验研究。材料和方法1.选用SPF级2～3月龄、200±20g雌性Wistar大鼠,每日清晨9:00行阴道涂片,显微镜下观察动情周期,选择有正常动情周期的大鼠进入实验。2.预实验:摸索空载慢病毒载体转染正常大鼠卵巢组织的最低有效剂量:12只大鼠随机分为3组,每组4只,均以水合氯醛按3ml/Kg腹腔注射麻醉后,自腹中线打开腹腔,暴露双侧卵巢。三组大鼠均在双侧卵巢实质分别注入携带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的空载-HIV-I,但剂量不同。第一组（低剂量组）:1μl;第二组（中剂量组）:5μl;第三组（高剂量组）:10μl。分别于注射后每日观察大鼠进食、大小便、活动、体毛、体重和动情周期情况;注射后第7、14、21、28天处死大鼠（每个时间点低剂量组n=1,中剂量组n=1,高剂量组n=1）,处死后取出双侧卵巢分别称重,然后行冰冻切片在荧光显微镜下观察各组EGFP的表达,同时行HE染色观察卵巢组织结构的变化情况。3.慢病毒介导Bcl-2基因对化疗后大鼠卵巢功能影响的动物实验:将60只雌性Wistar大鼠随机分为四组:①空白对照组15只:不予任何药物处理;②实验对照组15只;③空载对照组15只;④实验组15只。②③④组均采用同一方法及相同剂量建立化疗性卵巢衰竭模型,具体方法如下:实验开始后,每组均给予首次负荷剂量CTX 50 mg/（kg·d）,腹腔内注射,1 d;CTX 8 mg/（kg·d）,腹腔内注射,连续14 d。停药第1天,这三组均开腹行双卵巢局部注射,实验对照组注射生理盐水5μl;空载对照组注射空载HIV-I 5μl;实验组注射Bcl-2-HIV-I5μl。从实验开始到结束,四组大鼠每天行阴道涂片。在实验开始前、停药当天、停药第15天和第30天取血测定各组FSH、E₂浓度;停药第15天处死各组7只大鼠,停药第30天处死各组剩余大鼠,分别留取子宫和卵巢,所有标本均分别行石蜡包埋及冰冻切片,苏木素-伊红（Hematoxylin-Yihong,HE）染色。比较卵巢重量及卵泡数量变化,冰冻切片荧光显微镜下观察增强绿色荧光蛋白表达情况。采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL法）检测卵巢颗粒细胞凋亡情况及蛋白质免疫印迹法（Western blot法）检测抗凋亡蛋白Bcl-2的表达情况。研究结果1.空载慢病毒载体转染大鼠卵巢组织的最低有效剂量的确定（预实验）双侧卵巢实质注射不同剂量空载慢病毒载体后,三组大鼠进食及大小便正常,体重增加,活动灵敏,毛发润泽光亮,有正常的动情周期。分别于注射后的第7、14、21、28天处死每组一只大鼠,双侧卵巢分别称重。三组卵巢重量两两比较,均无统计学意义（P＞0.05）。卵巢行冰冻切片后在荧光显微镜下观察EGFP的表达。低剂量组第7、14、21和28天仅见部分卵巢组织内出现微弱的EGFP表达,感染效率为40%。中剂量组第7、14、21天EGFP的表达逐渐增强,至第28天开始稳定表达,感染效率可达90%以上。高剂量组从第7天至28天均见到较强的绿色荧光表达,但背景颜色较强,易影响观察的准确性。三组大鼠卵巢均行石蜡切片HE染色后,显微镜下见慢病毒载体注射的卵巢均未见明显的变性、坏死等病理形态学异常。低剂量组转染效率低,中、高剂量组的空载慢病毒载体都可以有效转染进大鼠卵巢组织,且3组大鼠一般情况及卵巢重量均无明显变化,由于卵巢体积较小,如注入卵巢组织的液体总量过大,对卵巢功能可能存在一定的影响。故在后续实验中采用最低有效剂量为5μl（中剂量组）。2.慢病毒介导Bcl-2基因对化疗性卵巢衰竭后大鼠血清FSH和E₂浓度的影响及其动情周期的变化（1）空白对照组大鼠整个实验过程中阴道涂片呈正常动情周期改变;其它三组大鼠阴道细胞涂片显示在给CTX 3～5天后出现持续不排卵,动情周期紊乱。实验组停药第15天左右恢复正常大鼠动情周期。实验对照组、空载对照组大鼠至停药第30天,动情周期仍未恢复。（2）实验组、实验对照组和空载对照组大鼠在成功建立卵巢衰竭模型后（即CTX注射第15天）,FSH、E₂浓度与各自实验前的浓度分别相比均有显著性差异（P＜0.05）。停药第15天实验组大鼠FSH浓度为（3.74±0.10）mIU/ml,高于空白对照组（3.33±0.08）mIU/ml,分别低于实验对照组和空载对照组水平（4.98±0.11及5.10±0.10）mIU/ml,也低于本组停药当天水平（4.67±0.09）mIU/ml;同期实验组E₂浓度为（39.54±1.99）pg/ml,低于同期空白对照组（51.99±2.11）pg/ml,分别高于同期实验对照组和空载对照组水平（30.37±1.50及29.44±1.16）pg/ml,也高于本组停药当天水平（31.10±0.91）pg/ml;实验组与其它三组分别比较,差异均有统计学意义（P＜0.05）。停药第30天实验组FSH浓度为（3.66±0.06）mIU/ml,仍高于空白对照组（3.36±0.12）mIU/ml,更低于实验对照组和空载对照组水平（5.65±0.08和5.66±0.08）mIU/ml;同期实验组E₂浓度更为升高,为（43.79±3.17）pg/ml,仍低于同期空白对照组（51.29±1.94）pg/ml,而同期实验对照组和空载对照组仍在（29.41±0.62和29.07±1.20）pg/ml间徘徊。实验组与其它三组分别比较,差异均有统计学意义（P＜0.05）。同时间段的实验对照组和空载对照组FSH、E₂浓度分别比较,差异均无统计学意义（P＞0.05）。3.慢病毒介导Bcl-2基因对化疗性卵巢衰竭大鼠卵巢重量的变化停药第15天,实验组大鼠卵巢重量为（46.00±0.87）mg,低于空白对照组（51.38±1.54）mg,高于其它两组（40.31±1.34及41.50±1.34）mg,分别比较差异均有统计学意义（P＜0.05）,后两组相互比较无统计学意义（P＞0.05）。停药第30天,实验组卵巢重量为（49.99±0.73）mg,仍低于空白对照组（51.85±1.18）mg,高于其它两组（32.72±1.26和33.37±1.84）mg,分别比较差异均有统计学意义（P＜0.05）,后两组比较仍无统计学意义（P＞0.05）。4.慢病毒介导Bcl-2基因对化疗性卵巢衰竭大鼠卵泡数量的变化停药第15天,实验组卵泡总数、原始卵泡数、生长卵泡数、成熟卵泡数均高于实验对照组及空载对照组,分别比较,差异均有统计学意义（P＜0.05）。之后实验组原始卵泡比例逐渐减少,成熟卵泡比例逐渐增多,而实验对照组及空载对照组卵泡总数及各期卵泡数量持续减少,其中成熟卵泡减少最为明显。至停药第30天,实验组各期卵泡数量均高于实验对照组及空载对照组,差异仍均有统计学意义（P＜0.05）。5.毒性试验取空载对照组和实验组处死的Wistar大鼠卵巢和子宫,行冰冻切片后,在荧光显微镜下观察,两组大鼠卵巢均可见较强荧光,子宫均未见荧光。HE染色后,显微镜下上述两组慢病毒载体注射的卵巢和子宫均未见明显的变性、坏死等病理形态学异常。6.TUNEL法检测细胞凋亡指数（Apoptosis Index,AI）停药第30天,实验组A I为（6.44±0.78）%,与空白对照组、实验对照组和空载对照组（2.58±0.26、18.53±0.84和18.94±0.43）%分别比较,差异均有统计学意义（P＜0.05）。7.Western blot电泳检测Bcl-2蛋白的表达停药第30天,实验组大鼠Bcl-2蛋白的定量表达分别为实验对照组的1.75倍,空载对照组的1.47倍;分别与实验对照组和空载对照组比较,差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论1.本研究发现慢病毒载体可成功转染大鼠卵巢组织,对大鼠的体重无明显影响,且对卵巢组织结构无明显改变,邻近器官子宫无荧光表达,慢病毒只局限在注射的局部。提示本研究使用的慢病毒载体具有安全性,为今后的临床实验奠定了基础。2.慢病毒介导Bcl-2基因成功转染大鼠卵巢组织后,可以抑制大鼠卵巢颗粒细胞的凋亡,可能是由于促进了Bcl-2抗凋亡蛋白分泌所致。3.慢病毒介导的Bcl-2基因可以部分改善化疗后大鼠卵巢功能,可能的机制为上调了Bcl-2基因表达水平,抑制了颗粒细胞的凋亡,进而促进了卵巢颗粒细胞分泌雌激素。4.由于实验条件有限,未能在停药后进行交配,故大鼠的生育功能是否恢复,有待以后进一步实验证明。

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摘要  3-10
ABSTRACT  10-21
前言  21-24
材料与方法  24-36
  一、材料  24
  二、主要试剂和仪器  24-25
  三、预实验:空载慢病毒载体转染大鼠卵巢组织的最低有效剂量  25-28
  四、慢病毒介导Bcl-2基因对化疗后卵巢功能的影响  28-30
  五、TUNEL原位检测颗粒细胞凋亡:  30-31
  六、凋亡相关蛋白的检测  31-35
  七、统计学分析  35-36
结果  36-44
  一、慢病毒载体转染大鼠卵巢组织的最低有效剂量的确定(预实验)  36-37
  二、慢病毒介导Bcl-2基因对化疗性卵巢衰竭后大鼠卵巢功能的变化  37-41
  三、毒性试验  41
  四、TUNEL法检测颗粒细胞的凋亡  41
  五、凋亡相关蛋白的检测:  41-44
讨论  44-52
  一、基因治疗的现状  44-46
  二、卵巢储备功能的评价  46-47
  三、CTX对大鼠卵巢功能的影响  47-48
  四、卵巢颗粒细胞凋亡的调控  48-49
  五、Bcl-2基因与卵巢颗粒细胞的凋亡  49-51
  六、Bcl-2抗调亡蛋白与大鼠卵巢功能  51-52
结论  52-53
参考文献  53-59
附录(Appendix)  59-60
  中英文对照缩略词表  59-60
综述  60-66
攻读学位期间成果  66-67
致谢  67-69
统计学证明  69

慢病毒介导Bcl-2基因在大鼠体内的表达及对化疗后卵巢功能影响的动物实验研究

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