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c-myc反义寡核苷酸对结肠癌HT29细胞增殖、凋亡及化疗敏感性研究

作　者: 邵国利
导　师: 吴爱国
学　校: 南方医科大学
专　业: 普通外科学
关键词: c-myc基因反义寡核苷酸反义治疗结直肠癌
分类号: R735.35
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

大肠癌是最常见的恶性肿瘤之一,全世界范围内,大肠癌发病率排在恶性肿瘤的第3位。在我国,随着生活水平的不断提高,饮食习惯的改变,大肠癌的发病率呈逐年上升趋势以4.2%的平均速度递增。目前大肠癌的治疗方法以手术切除为主,辅以化疗和放疗等综合治疗。大肠癌是一种全身性疾病,虽然肿瘤被完全切除,但是在原发肿瘤出现明显症状之前,可能已经发生播散性转移,约半数病例术后2年出现复发和转移。20世纪八十年代末新辅助化疗被应用于大肠癌,并作为围手术期治疗的重要辅助手段。新辅助化疗的意义在于降低手术后复发、减少远处转移、提高切除率和治愈率、延长生存期、改善术后生存质量,它的积极意义已经被大多数学者所认可。但化疗最大的障碍是肿瘤细胞的多耐药性,特别是大肠癌细胞的多药耐药（MDR）基因原发性高表达或继发性高表达,使得大肠癌细胞的多耐药性明显高于其他肿瘤,因此大肠癌的化疗效果明显低于其他肿瘤。人们对大肠癌的认识已达到细胞分子生物学水平。大肠癌从遗传学和分子生物学角度认识,是一种基因病,即癌基因的激活和抑癌基因的失活,以及基因表达调控失常。大肠癌发生的分子基础是多种基因突变长期、多阶段、多步骤的积累过程。大肠癌基因治疗已成为研究热点之一并已经从基础理论阶段进人临床试验阶段。目前大肠癌基因治疗基础研究主要有:①细胞因子基因治疗;②针对癌基因和抑癌基因的治疗;③反义基因治疗;④自杀基因治疗;⑤多药耐药基因治疗;⑥抗肿瘤血管形成基因治疗;⑦放射基因治疗等。反义寡核苷酸（antisense oligonucleartides,ASODN）技术的基本原理是根据Watson-Crick碱基互补配对规律和核酸杂交原理,设计出能与靶基因特定区域结合的互补反义寡核苷酸片段,与靶基因（DNA）或信使核糖核酸（mRNA）的特定序列相结合,以影响靶基因的表达、抑制其功能,而其他基因的转录和表达则不受影响。反义概念由Zamecnik和Stephenso在1978年首次描述,20多年来,大量研究证实了ASODN特异性抑制基因表达的能力,人们也逐渐认识到其在疾病治疗方面的巨大潜能。反义寡核苷酸（ASODN）对基因表达的抑制作用可通过多种不同的机制而实现:①抑制基因转录,即ASODN与DNA双螺旋分子的特异序列结合形成三螺旋DNA以阻止基因的转录;②抑制RNA的加工,主要是抑制mRNA前体的剪接;③抑制RNA的翻译,如果ASODN序列与目的mRNA翻译起始序列互补,二者杂交结合,可阻止mRNA进入核糖体,而抑制翻译的起始;如果ASODN与mRNA起始位点下游序列互补,二者结合能阻止核糖体在mRNA上的移动而终止翻译的进行;④诱导RnaseH（RNA酶H）介导的RNA降解作用,这可能是反义抑制作用的最主要的机制。RnaseH能裂解DNA-RNA杂化双链中的RNA链。当ASODN与目的mRNA结合成杂化双链时,即可启动RnaseH的裂解功能,将目的mRNA链降解,从而抑制基因表达蛋白的产生。反义治疗的优点:①反义化合物的靶点是引起肿瘤的癌基因,通过调控基因产物的表达而发挥治疗作用。当致病蛋白质大量存在时,针对蛋白质的传统药物难以治疗的情况下,反义治疗时一种较为有效的治疗方法;②反义化合物可用于治疗传统药物不能治愈的基因疾病;③反义治疗比表达载体基因治疗更为安全有效,不良反应更少;④用于反义治疗的化合物的费用可能比传统药物更为低廉。反义治疗因其具有高特异性和低毒副作用,在肿瘤治疗学研究中颇受重视,研究进展极为迅速,经不断完善和改进,已逐步进入临床,并显示出辉煌的应用前景。目前已有应用ASODN治疗一些恶性肿瘤的研究,如慢性淋巴细胞性白血病、神经母细胞瘤、膀肌癌、多发骨髓瘤、乳腺癌、胃癌、结肠癌、间皮瘤和肺癌等,已经取得了一定的疗效。c-myc基因属于myc原癌基因家族,定位于染色体8q24,c-myc基因主要通过扩增和染色体易位重排的方式激活,与某些组织肿瘤的发生、发展和演变转归有重要关系。c-myc癌基因属核蛋白基因,具有转化细胞的能力,并具有与染色体DNA结合的特性,在调节细胞生长、分化及恶性转化中发挥作用。c-myc的表达活性与细胞生长、分裂速度密切相关,而且也是细胞凋亡的潜在诱导因子。在不同的人体肿瘤细胞系中,包括粒细胞性白血病细胞系,视网膜母细胞瘤细胞系,某些神经母细胞病细胞系,乳腺癌细胞系及某些肺癌细胞系,已发现c-myc过度表达,在人结肠癌细胞系中也观察到c-myc基因的扩增。c-myc基因还参与了肿瘤的血管新生,在肿瘤的生成过程中,c-myc基因扮演着控制血管生长作用,而这个发现也使得c-myc成为人类对抗肿瘤的新希望。国内外已经有利用c-myc ASODN对心血管疾病、乳腺癌、骨肉瘤、卵巢癌、肝癌、肺癌、肾癌等的相关研究。c-myc ASODN在降低乳腺癌细胞耐药性、诱导胃癌细胞、卵巢癌细胞、膀胱癌细胞、肝癌细胞、淋巴瘤细胞凋亡及抑制肺癌细胞生长等方面都有较好的效果,有研究显示,c-myc暂时受抑也足以使肿瘤永久停止生长。目前对大肠癌全身辅助化疗的研究非常活跃,并且取得令人瞩目的进展。临床上大肠癌一线化疗以铂类和氟尿嘧啶为主,但耐药性及副作用大等缺点也限制了其应用。联合ASODN和传统化疗药物已成为肿瘤研究中较为常见的策略。近年来经细胞凋亡机制的研究证实,抗细胞凋亡因子在肿瘤细胞的生长及耐药性产生中起着重要作用。c-myc是细胞凋亡的重要调控基因,与肿瘤耐药的形成有密切关系。ASODN具有增强化疗效果的作用,将ASODN与奥沙利铂等化疗药物同时应用于大肠癌细胞,这就使两种抗肿瘤机制有机结合,实现抑制大肠癌细胞增值和扩散,促进其凋亡的目的,孙等人的研究表明c-mycASODN可通过下调卵巢癌c-myc的表达,逆转卵巢癌对DDP耐药。Nita等应用针对Bcl-x（L）的ASODN能提高结肠癌对5-Fu化疗的敏感性。基于前述国内外研究现状,在反义核酸技术日渐成熟的基础上,本研究拟合成多条c-myc反义寡核苷酸链,利用脂质体将c-myc的ASODN导入大肠癌HT29细胞中,抑制或封闭c-myc基因的表达,从而达到抑制肿瘤的生长、增值、分化和诱导其凋亡的目的。同时因ASODN具有增强化疗效果的作用,应用针对c-myc的ASODN,同时应用奥沙利铂等化疗药物,利用MTT方法检测其是否能够提高结直肠癌对奥沙利铂等化疗药物的敏感性。这种肿瘤治疗方法把反义核酸技术同化疗进行了完美的结合,具有极大的临床研究价值。目的人工设计并合成c-myc ASODN,利用脂质体将其转染入大肠癌HT29细胞,研究体外c-myc ASODN阻断人大肠癌HT29细胞中c-myc基因mRNA及蛋白的表达,观察其对细胞增殖抑制、凋亡及化学治疗敏感性的影响,为大肠癌的基因治疗奠定科学的基础。方法1.利用脂质体Lipofectamine^TM2000,将c-myc ASODN转染入大肠癌HT29细胞中;2.逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）方法检测转染c-myc ASODN 24h后HT29细胞中c-myc基因mRNA的表达;3.Western blot方法检测转染c-myc ASODN 48h后HT29细胞中c-myc基因蛋白的表达;4.流式细胞仪（FCM）检测c-myc ASODN对人结肠癌HT29细胞凋亡的影响;5.MTT检测c-myc ASODN对人结肠癌HT29细胞增殖抑制及其对奥沙利铂敏感性影响。结果1.转染c-myc ASODN24h后,HT29细胞内c-myc mRNAm达水平较对照组显著降低,且c-myc ASODN高浓度组c-myc mRNA表达量较低浓度组低（P＜0.05）;2.Western blot检测表明在HT29细胞中存在分子量62kD的特异性条带,与c-myc分子量相符,ASODN组在PVDF膜上的特异性条带明显弱于对照组,差异具有统计学意义（P＜0.05）;3.MTT法检测显示不同浓度的c-myc ASODN对HT29细胞均有抑制作用,四个不同的时间,细胞增值抑制率之间差异有显著性意义（P＜0.05）,随着药物浓度的增加,c-myc ASODN对HT29细胞的抑制率也增加,呈现出剂量、时间依赖性（P＜0.05）;4.FCM显示HT29细胞经c-myc ASODN（转染浓度1200nmol/L）处理72h后,细胞凋亡比例显著增加,脂质体对照组与c-myc ASODN组细胞凋亡率有显著性差异（P＜0.05）;5.将c-myc ASODN与奥沙利铂同时应用后,随着药物浓度及时间的增加,奥沙利铂对HT29细胞的抑制率较对照组显著增加,呈现出剂量、时间依赖性（P＜0.05）。相同浓度的奥沙利铂,实验组HT29细胞生长抑制率（奥沙利铂+c-mycASODN+脂质体）与对照组（奥沙利铂+脂质体对照组）相比具有显著性差异（P＜0.05）。根据连续0～4d MTT测试结果,绘制生长曲线（图7）,可见实验组的HT29细胞增殖速度比对照组明显降低（P＜0.05）。结论1.体外c-myc ASODN可抑制c-myc mRNA及蛋白的表达;2.阻断c-myc基因表达可抑制HT29细胞的增殖,并促进HT29细胞凋亡;3.联合应用c-myc ASODN和奥沙利铂可逆转HT29细胞对奥沙利铂的耐药性,增强其对奥沙利铂的敏感性;4.反义核酸技术具有极大的试验研究和临床研究价值,c-myc ASODN可能为大肠癌的基因治疗提供有临床治疗意义的靶点。

全文目录

摘要  3-8
ABSTRACT  8-17
绪论  17-24
  参考文献  20-24
第一章 c-myc反义寡核酸对体外结肠癌HT-29细胞增殖、凋亡的影响  24-44
  1.1 材料与试剂  24-29
  1.2 实验方法  29-35
  1.3 结果  35-40
  1.4 讨论  40-42
  1.5 结论  42
  参考文献  42-44
第二章 c-myc ASODN联合奥沙利铂对结肠癌HT29细胞增值抑制的实验研究  44-51
  2.1 细胞准备  45
  2.2 实验分组  45
  2.3 MTT法测定HT29细胞生长的抑制情况  45
  2.4 统计学处理  45
  2.5 结果  45-47
  2.6 讨论  47-49
  2.7 结论  49
  参考文献  49-51
综述  51-58
附录中英文对照缩略词表  58-60
攻读学位期间成果  60-61
致谢  61-62
南方医科大学研究生毕业论文统计学审稿证明  62-63

c-myc反义寡核苷酸对结肠癌HT29细胞增殖、凋亡及化疗敏感性研究

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