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大黄总蒽醌及其衍生物对LoVo、NRK细胞AQP2、AQP4表达的调节效应与机制

作　者: 刘青
导　师: 李锋；刘晓渭；李军昌
学　校: 第四军医大学
专　业: 中西医结合临床
关键词: 大黄/大黄总蒽醌/大黄总蒽醌含药血清/大黄蒽醌衍生物/大黄素/大黄酸/大黄酚 LoVo细胞 NRK细胞泻下利尿药理效应水通道蛋白/水通道蛋白2/水通道蛋白4 蛋白激酶A 血清药理学
分类号: R285
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

中医药文献记载,大黄不仅具有“泻下”功效,还具有明显的“利尿”功效。水通道蛋白（aquaporines,AQPs）是细胞膜上的一种与水的通透性有关的转运膜蛋白,影响水的跨膜转运。其中已确定水通道蛋白2（aquaporin2,AQP2）和水通道蛋白4（aquaporin4,AQP4）在结肠、肾脏表达,并初步证实大黄的“泻下”、“利尿”功效与其对结肠、肾脏的AQP2、AQP4表达的调节有关。本研究以来源于人结肠腺癌的细胞系LoVo及来源于正常大鼠肾细胞的细胞系NRK（Normal Rat Kidney）为靶细胞,进一步从体内外观察大黄总蒽醌及其衍生物对LoVo、NRK细胞AQP2、AQP4表达的调节效应。首先通过给予SD大鼠不同剂量的大黄总蒽醌灌胃,取血制成含药血清,培养LoVo、NRK细胞,应用免疫荧光、Western Blot和RT-PCR等方法检测LoVo、NRK细胞AQP2、AQP4表达的调节效应与机制。而后,观察大黄酚对LoVo细胞AQP2、AQP4表达的调节效应与机制,完善前研究。最后,观察大黄素、大黄酸、大黄酚对NRK的AQP2、AQP4表达的调节效应与机制。实验一:大黄总蒽醌含药血清对LoVo细胞AQP2、AQP4表达的调节效应与机制目的:探讨大黄总蒽醌含药血清对体外培养培养LoVo细胞AQP2、AQP4的调节效应及机制。方法:16只SD大鼠随机分为正常组、大黄总蒽醌低、中、高剂量组(0,1400,2500,4500㎎·㎏^-1·d^-1,灌胃),7d后麻醉处死取血制备含药血清。体外培养LoVo细胞并给予不同浓度大黄总蒽醌含药血清培养液24 h处理,采用免疫荧光AQP2、AQP4定位,Western Blot及半定量RT-PCR检测AQP2、AQP4蛋白及mRNA的表达。采用非放射性法检测药物处理24 h后的LoVo细胞PKA活性水平。结果:AQP2、AQP4主要表达在LoVo细胞膜上。Western Blot及半定量RT-PCR结果显示,4500㎎·㎏^-1·d^-1大黄总蒽醌含药血清培养液可抑制LoVo细胞的AQP2、AQP4蛋白及mRNA的表达（P<0.01）。PKA活性结果显示,4500㎎·㎏^-1·d^-1大黄含药血清组能降低LoVo细胞的PKA磷酸化水平（P<0.05）。实验二:大黄总蒽醌含药血清对NRK细胞AQP2、AQP4表达的调节效应与机制目的:探讨大黄总蒽醌含药血清对体外培养培养NRK细胞AQP2、AQP4的调节效应及机制。方法:16只SD大鼠随机分为正常组、大黄总蒽醌低、中、高剂量组(0,1400,2500,4500㎎·㎏^-1·d^-1,灌胃),7d后麻醉处死取血制备含药血清。体外培养NRK细胞并给予不同浓度大黄总蒽醌含药血清培养液24 h处理,采用免疫荧光检测AQP2、AQP4定位,Western Blot及半定量RT-PCR检测AQP2、AQP4蛋白及mRNA的表达。采用非放射性法检测药物处理24 h后的NRK细胞PKA活性水平。结果:AQP2、AQP4主要表达在NRK的细胞膜上。Western Blot及半定量RT-PCR结果显示,2500,4500㎎·㎏^-1·d^-1大黄总蒽醌含药血清培养液可抑制NRK细胞的AQP2、AQP4蛋白及mRNA的表达（P<0.05）。PKA活性结果显示,4500㎎·㎏^-1·d^-1大黄总蒽醌含药血清组能降低NRK细胞的PKA磷酸化水平（P<0.05）。实验三:大黄酚对LoVo细胞AQP2、AQP4表达的调节效应与机制目的:探讨大黄酚对体外培养LoVo细胞AQP2、AQP4表达的调节效应及机制。方法:体外培养LoVo细胞,分为两步实验:第一步随机分为对照组和10 mg/L,20 mg/L,40 mg/L大黄酚处理组,采用Western Blot、半定量RT-PCR检测药物处理24 h后AQP2、AQP4蛋白及mRNA的表达;第二步随机分为对照组,40 mg/L大黄酚,10 mg/L 8-Bromo-cAMP、40 mg/L大黄酚+10 mg/L 8 -Bromo-cAMP,非放射性法检测药物处理24 h后的LoVo细胞PKA活性水平。结果:20,40 mg/L大黄酚处理组AQP2、AQP4蛋白及mRNA的表达降低（P<0.05）。PKA活性结果显示,40mg/L大黄酚组能降低LoVo细胞的PKA磷酸化水平（P<0.05）。实验四:大黄素、大黄酸、大黄酚对NRK细胞AQP2、AQP4表达的调节效应与机制目的:探讨大黄素、大黄酸、大黄酚对体外培养NRK细胞AQP2、AQP4表达的调节效应及机制。方法:体外培养NRK细胞,并给予不同质量浓度（5 mg/L,10 mg/L,20 mg/L）大黄素或大黄酸或大黄酚含药培养液24h,采用Western Blot、半定量RT-PCR检测AQP2、AQP4蛋白及mRNA的表达;非放射性法检测药物处理24 h后的NRK细胞PKA活性水平。结果:10,20 mg/L大黄素、大黄酸、大黄酚处理组AQP2、AQP4蛋白及mRNA的表达降低（P<0.05）。大黄素、大黄酸、大黄酚之间无显著性差异（P>0.05）。PKA活性结果显示,20mg/L大黄素、大黄酸、大黄酚组均能降低NRK细胞的PKA磷酸化水平（P<0.05）。结论:1.大黄总蒽醌含药血清、大黄酚能有效抑制LoVo细胞AQP2、AQP4的基因转录与翻译,显示大黄总蒽醌含药血清、大黄酚通过抑制结肠上皮细胞的AQP2、AQP4的表达,抑制结肠水分吸收,增加结肠内容物水分含量。提示大黄“泻下”功效与其调节AQPs效应有关。2.大黄总蒽醌含药血清、大黄素、大黄酸、大黄酚能有效抑制NRK细胞AQP2、AQP4的基因转录与翻译,显示大黄总蒽醌含药血清、大黄素、大黄酸、大黄酚通过抑制肾脏上皮细胞的AQP2、AQP4的表达,抑制肾脏对水分的重吸收。提示大黄“利尿”功效与其调节AQPs效应有关。3.大黄可能通过调节PKA这一细胞信号转导通路而下调AQP2的表达。4.大黄总蒽醌及其衍生物对结肠与肾脏的AQP2、AQP4表达的调节效应,提示大黄能同时调节结肠与肾脏的水液代谢,可能是大黄具有多重功效的机制之一。

大黄总蒽醌及其衍生物对LoVo、NRK细胞AQP2、AQP4表达的调节效应与机制

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