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淋病奈瑟菌粘附因子受体hCEACAM1转基因小鼠模型的建立及初步应用

作　者: 王小红
导　师: 李国才
学　校: 扬州大学
专　业: 动物学
关键词: 淋病奈瑟菌粘附因子 Opa蛋白 hCEACAM1 转基因小鼠
分类号: R759
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)是导致人类淋病(gonorrhea)的病原菌。人是淋病奈瑟菌的唯一宿主,经性行为传播,多侵袭泌尿生殖道黏膜,主要引起男性的急性尿道炎、前列腺炎、附睾炎等;在女性主要以隐形感染为主,常因不能及时医治而最终导致盆腔炎、子宫内膜炎、输卵管炎、甚至导致不孕症。淋病在全球范围内流行广泛,是发病率最高的性传播疾病(STD)之一。近年来随着淋病奈瑟菌耐药性的日益增强,淋病的治疗变得越发困难,深入研究淋病奈瑟菌的生物学特性及其与宿主间的相互作用机制,研制有效的淋病疫苗和治疗药物成为淋病防治工作的重中之重。但是缺乏有效的动物模型却阻碍着淋病的研究进程。研究证实,黏附定植于黏膜组织是淋病奈瑟菌感染的第一步,也是关键性的一步。淋病奈瑟菌的黏附定植是一个非常复杂的过程,涉及淋病奈瑟菌多种黏附因子和机体细胞上相应受体间的相互作用,其中Opa蛋白与其受体间的结合使得淋病奈瑟菌最终得以实现感染。Opa蛋白是淋病奈瑟菌编码的一组易变异的外膜蛋白,共有11～12种:OpaA、B、C……K(L)。绝大多数种类的Opa蛋白可以人癌胚抗原相关细胞黏附分子1 (human carcinoembryonic antigen related cellular adhesion molecule 1, hCEACAM1)为受体,95%以上的淋病奈瑟菌临床分离株均可与hCEACAM1结合。Opa蛋白与hCEACAM1的结合使得淋病奈瑟菌的黏附作用更加紧密,淋病奈瑟菌进而穿过上皮细胞,进入黏膜下层产生炎症。直接表达于泌尿生殖道黏膜上皮细胞顶面的hCEACAM1提供了淋病奈瑟菌感染的穿入点或侵入组织的一扇门,在淋病奈瑟菌的感染过程中具有重要意义。细胞模型研究证明,表达hCEACAM1的动物细胞均可以接受淋病奈瑟菌的粘附和侵入,提示hCEACAM1转基因小鼠可成为淋病研究的良好动物模型。本课题利用前期构建的hCEACAM1真核表达载体,通过显微注射法制备了hCEACAM1转基因小鼠,并初步研究了其在淋病奈瑟菌感染动物模型中的应用价值。研究主要分为以下几个部分:一、显微注射法制备hCEACAM1转基因小鼠在本实验室前期工作的基础上,将表达hCEACAM1的基因构件通过显微注射的方法注射到C57BL/6品系小鼠的受精卵中,得到hCEACAM1转基因F0代小鼠共22只。通过PCR技术反复筛选并将PCR产物测序分析,得到4只(50#、53#、54#、59#)PCR阳性的hCEACAM1 F0代转基因小鼠。初筛后的4只PCR阳性小鼠分别与同品系正常小鼠交配繁殖,得到的F1代小鼠通过PCR方法反复筛选,对阳性小鼠进行同组间的兄妹交配,得到F2、F3代转基因小鼠。F2、F3代转基因小鼠同样通过PCR的方法进行反复筛选,得到的阳性小鼠继续采用同组的兄妹交配方法进行繁殖,以期能得到纯合子的hCEACAM1转基因小鼠。二、hCEACAM1多克隆抗体的制备为了进一步分析hCEACAM1蛋白在转基因小鼠体内的表达情况,通过分析,找出hCEACAM1蛋白胞外区中抗原特异性最强的一段表位,采用PCR方法扩增出其编码序列,并将其连进pGEX-4T-1载体中,进行原核表达。以表达的GST-hCEACAM1融合蛋白为抗原,应用切胶免疫的方法制备了抗hCEACAM1的多抗血清。通过与商品化的hCEACAM1单抗比较,证实了所制备的抗hCEACAM1多抗血清能特异性识别hCEACAM1蛋白。三、hCEACAM1转基因小鼠体内目的基因的表达应用制备的hCEACAM1多抗血清对4只F0代PCR阳性转基因小鼠进行了体内hCEACAM1蛋白表达情况的分析。通过Western-blot方法证实,在4只F0代PCR阳性小鼠中,只有53#F0代小鼠及其后代体内各组织器官表达了hCEACAM1蛋白,同时应用免疫荧光的方法证实了hCEACAM1蛋白定位表达于细胞膜上。由此鉴定,我们成功获得了hCEACAM1转基因小鼠。四、hCEACAM1转基因小鼠的淋病奈瑟菌感染实验为研究hCEACAM1转基因小鼠在淋病研究中的应用价值,我们在转基因小鼠数量较少的情况下,选择了4只hCEACAM1阳性小鼠,进行了淋病奈瑟菌体内感染实验。实验结果表明,相对于对照组的正常小鼠,淋病奈瑟菌在hCEACAM1转基因小鼠中的存活时间显著延长,但是没有引起小鼠产生炎症反应。由于实验小鼠的数量严重不足,这只是对淋病奈瑟菌体内感染实验的一个初步探索,不具有统计学意义,但其结果预示着其作为研究淋病动物模型的可能性。

全文目录

中文摘要  5-8
英文摘要  8-12
符号说明  12-14
文献综述： CEACAM1 研究进展  14-24
  参考文献  19-24
研究内容一： hCEACAM1 多克隆抗体的制备  24-40
  摘要  24-25
  1. 材料和方法  25-33
  2. 结果  33-36
  3. 讨论  36-37
  参考文献  37-39
  Abstract  39-40
研究内容二：hCEACAM1 转基因小鼠的建立  40-54
  摘要  40
  1. 材料和方法  40-44
  2. 结果  44-50
  3. 讨论  50-51
  参考文献  51-53
  Abstract  53-54
研究内容三：hCEACAM1 转基因小鼠体内目的基因的表达  54-63
  摘要  54
  1. 材料和方法  54-57
  2. 结果  57-60
  3. 讨论  60-61
  参考文献  61-62
  Abstract  62-63
研究内容四：淋病奈瑟菌感染 hCEACAM1 转基因小鼠初步研究  63-69
  摘要  63
  1. 材料和方法  63-65
  2. 结果  65-66
  3. 讨论  66-67
  参考文献  67-68
  Abstract  68-69
结论  69-70
致谢  70-72
攻读学位期间发表的学术论文  72

淋病奈瑟菌粘附因子受体hCEACAM1转基因小鼠模型的建立及初步应用

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