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卡那霉素对乙酰胆碱调节耳蜗外毛细胞的影响

作　者: 高青华
导　师: 汤浩
学　校: 中国医科大学
专　业: 生理学
关键词: 外毛细胞卡那霉素耳毒性乙酰胆碱 Ca2+
分类号: R764.43
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

目的氨基甙类抗生素（aminoglycoside antibiotics,AmAn）是广泛使用的抗生素品种之一,但存在耳毒性、肾毒性等副作用。研究证实,AmAn损害内耳感受器,引起听觉和前庭功能障碍,因此限制了这类抗生素的临床应用。在众多实验研究中发现,AmAn对哺乳动物耳蜗外毛细胞（outer hair cell,OHC）的损伤最为明显。OHC主要受内侧橄榄耳蜗束（MOC）传出神经支配,传出神经末梢与OHC形成突触连接,其主要神经递质为乙酰胆碱（ACh）。已知这种传出神经支配对OHC的调控作用主要是保护其不受外界超强声音刺激。目前研究表明乙酰胆碱受体（AChR）是由α9和α10亚基组成的聚合物,具有混合的N、M受体敏感性的药理特征,同源表达的α9受体能够被氨基甙类抗生素非竞争性阻断,因此推断这类药物的耳毒性作用在某些方面可能是由于其与乙酰胆碱受体结合,阻碍了乙酰胆碱与受体的正常结合,从而减弱了传出神经系统的保护作用,使外毛细胞受到损伤。本研究通过建立卡那霉素豚鼠耳毒模型,采用电生理学方法记录听觉脑干反应（ABR）阈值并结合形态学、细胞学方法,观察卡那霉素对豚鼠听觉功能以及乙酰胆碱调节豚鼠耳蜗外毛细胞的影响,进而间接证明卡那霉素耳毒作用的机制与耳蜗ACh调节异常的相关性。实验方法1、实验动物分组及耳毒模型制备选用耳廓反射灵敏的健康白色红目豚鼠24只,雌雄不拘,体重约为200-250克。将豚鼠随机分为3组:①对照组②卡那霉素给药3天组③卡那霉素给药6天组,每组8只。对照组每日肌肉注射生理盐水2.5ml/kg;卡那霉素组每日肌肉注射卡那霉素400mg/kg。每日测量体重以调整药量。2、ABR阈值检测各组豚鼠于用药前及停药后1天分别测试ABR。使用听觉脑干反应系统,测试强度由95dB SPL开始,按5dB SPL逐档递减,听阈判断以ABR的P3波为准。3、耳蜗基底膜铺片硝酸银染色检测外毛细胞将各组豚鼠断头取听泡,暴露耳蜗,从蜗尖向蜗内轻轻推注0.5%的AgNO₃溶液5ml,置于0.5%AgNO₃溶液中15min,蒸馏水漂洗,用4%多聚甲醛溶液固定4h以上,同时在日光下曝光1-1.5h,然后在解剖显微镜下分离基底膜,置于载玻片上,用甘油盖玻片封片镜检,观察各组外毛细胞分布及形态学特点。4、免疫组化检测耳蜗乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase,AChE）表达各组豚鼠停药并测试完ABR后,立即断头处死,速取听泡,经固定、脱钙后行石蜡包埋,平行蜗轴连续切片,将各组切片进行AChE免疫组织化学染色,阴性对照组用PBS代替一抗,其他不变。检测时,将切片置于显微镜下,每张切片均取柯蒂氏器作为视野,数码相机拍照,用显微图像分析系统测定各组AChE阳性反应的平均灰度值。灰度值越小,表示阳性反应越强。5、外毛细胞的急性分离将豚鼠迅速断头处死,取出两侧听泡,在人工外淋巴液中打开听泡,剔除耳蜗骨壳,切下二至顶转耳蜗,放入含有0.25%胰蛋白酶的无钙人工外淋巴液中,温度为20-25℃,消化10min,弃去酶液,人工外淋巴液反复冲洗三次以终止消化。用细口径吸管反复吹打至细胞离散,将OHC悬液放人冰箱（4℃）或置室温保存。6、荧光测钙选择分离活性好的OHC,按以下分组进行实验:①对照组、②ACh组、③ACh+卡那霉素组。OHC悬液中加入Fluo-3/AM避光孵育30min,用显微荧光测钙系统检测Fluo-3荧光强度的变化。荧光图象记录于计算机中,用配套软件分析荧光强度变化,荧光强度表示游离钙浓度的高低。7、统计分析:所有数据均以均数±标准差（（?）±s）表示,用excel软件进行t检验。结果1、ABR阈值检测用药前各组豚鼠ABR阈值无显著性差异（P＞0.05）;用药后卡那霉素给药3天组ABR阈值无明显变化（P＞0.05）;卡那霉素给药6天组ABR阈值升高明显,与对照组相比有显著性差异（P＜0.01）。2、外毛细胞的改变耳蜗基底膜铺片显示:对照组耳蜗外毛细胞呈三排,分布均匀,无明显缺失;卡那霉素给药3天组外毛细胞略有减少,但与对照组相比差异不明显;卡那霉素给药6天组外毛细胞缺失明显（P＜0.01）。3、豚鼠耳蜗AChE的表达正常对照组耳蜗柯蒂氏器AChE呈弱阳性表达,卡那霉素给药3天组AChE阳性反应产物的平均灰度值比对照组有所减少,卡那霉素给药6天组AChE阳性反应产物的平均灰度值与卡那霉素给药3天组相比进一步减少,呈强阳性表达。4、单离外毛细胞的形态特征及钙成像倒置显微镜下可见正常活性良好的OHC呈试管样,细胞膜光滑完整,膜周围有明显光晕,细胞核位于底部,细胞底部可见残存突触结构,表皮板上可见纤毛。钙荧光成像伪彩图形态与光镜下所见相同,细胞核内钙荧光强度高于胞浆,细胞底部荧光强度高于顶部。5、外毛细胞内Ca²⁺浓度变化情况对照组和人工外淋巴液不加入ACh时,OHC内Ca²⁺荧光强度基本不变。加入ACh后Ca²⁺荧光强度值缓慢升高,20min后达到峰值。ACh组OHC Ca²⁺荧光强度峰值平均上升幅度为2.32+0.32倍（n=6）,卡那霉素+ACh组OHC内Ca²⁺荧光强度峰值平均上升幅度为1.51±0.41倍（n=6）,两组t检验有显著差别（P＜0.01）。结果表明卡那霉素能明显抑制ACh引起OHC内Ca²⁺浓度升高的幅度。结论1、卡那霉素可升高豚鼠ABR阈值;导致外毛细胞损伤。2、卡那霉素可引起耳蜗乙酰胆碱酯酶表达增高。3、卡那霉素可降低ACh升高外毛细胞内Ca²⁺浓度的幅度。

全文目录

一、摘要  4-11
  中文论著摘要  4-7
  英文论著摘要  7-11
二、英文缩略语  11-12
三、论文  12-22
  前言  12
  实验材料与方法  12-15
  实验结果  15-20
  讨论  20-21
  结论  21-22
四、本研究创新性的自我评价  22-23
五、参考文献  23-25
六、附录  25-37
  综述  25-35
  在学期间科研成绩  35-36
  致谢  36-37
  个人简介  37

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