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脂肪干细胞复合壳聚糖—胶原—硫酸软骨素多孔支架体外成软骨能力的实验研究

作　者: 于志永
导　师: 付勤
学　校: 中国医科大学
专　业: 骨科学
关键词: 干细胞支架软骨组织工程脂肪组织
分类号: R318.08
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

实验目的冷冻干燥法制备壳聚糖-胶原-硫酸软骨素三维支架,将其与大鼠脂肪干细胞复合培养,在成软骨诱导培养条件下探讨其作为软骨组织工程支架的可行性,为关节软骨缺损的修复提供实验依据。实验方法1、支架材料的制备,将5%的胶原溶液与2%的壳聚糖乙酸溶液以7:3的体积比混匀。-80度冷冻2小时,冷冻干燥机中冷冻干燥12小时,将冻干的支架切成直径5mm高2mm的圆柱体。浸入2ml含50mmol/L 2-吗啉乙烷磺酸、50 mmol/L碳化二亚胺及50 mmol/L N-羟基琥珀酰亚胺,2%硫酸软骨素的体积分数为40%的乙醇中室温交联6小时。0.1mol/L Na2HPO4(pH 7.4)室温孵育1.5h,体积分数为0.4的乙醇清洗3次,30 min/次,双蒸水反复洗至中性,再次冷冻干燥。即得壳聚糖-胶原-硫酸软骨素支架材料。2、细胞的分离,扩增无菌条件下取SD大鼠双侧腹股沟脂肪组织,剪碎,0.25%胰蛋白酶和0.1%的胶原酶37度消化20分钟,1000g离心8min,含10%胎牛血清的DMEM重悬,接种于培养瓶中培养。待细胞生长至接近融合时胰酶/EDTA消化传代。3、细胞的种植和实验分组取第3代细胞,调整细胞密度为2×10~6/ml接种到支架上,实验组为成软骨诱导培养基。对照组培养基中除不含TGF-β1外,余与实验组相同。4、观察指标的检测:(1)光镜观察ADSC的生长,流式细胞学检测脂肪干细胞的表面标志;(2)体积法和称重法测定支架材料的孔隙率和吸水性;(3)扫描电镜及HE染色观察支架材料的形态结构和扫描电镜观察细胞支架复合物的形态结构;(4)免疫组织化学染色,RT-PCR,Western Blot检测诱导后的脂肪干细胞的成软骨表达。实验结果扫描电镜及HE结果,支架材料内部呈多孔的海绵状结构,各孔相互联通,孔径大小均一,孔径大小约为100-120微米。细胞接种后24小时,与支架黏附良好。培养三周后细胞重叠生长,成多层状,并分泌大量的细胞外基质。支架的吸水性为90.05±0.42%,,孔隙率为92.23±1.68%脂肪干细胞的形态特征,原代脂肪干细胞接种后24小时可见有少量的细胞贴壁,形态为小圆形,短梭形及多角形,3天后贴壁细胞明显增多,类似成纤维细胞样,约9天左右细胞融合超过90%。流式细胞仪检测表明,脂肪干细胞其表面CD29为80.2%,CD44为30.2%,而CD34,CD45的表达均不足5%。培养三周后免疫组化染色结果表明实验组有被染成深棕黄色的区域,表明有Ⅱ型胶原的生成,而对照组染色几乎为阴性诱导培养三周后实验组有Ⅱ型胶原和蛋白聚糖mRNA条带的表达,对照组几乎无Ⅱ型胶原和蛋白聚糖mRNA的表达,Western-blot检测表明实验组有Ⅱ型胶原蛋白的表达,而对照组没有。实验结论壳聚糖-胶原-硫酸软骨素复合支架材料有合适的孔隙率和吸水性,有利于细胞生长所需的营养物质和代谢产物的运输,同时其又有利于细胞的黏附与增值,可为脂肪干细胞生长分化及组织形成提供一个良好的环境,在软骨组织工程的领域有较广阔的应用前景。

全文目录

一、摘要  4-9
  中文论著摘要  4-6
  英文论著摘要  6-9
二、英文缩略语  9-10
三、论文  10-22
  前言  10-11
  实验材料与方法  11-14
  实验结果  14-19
  讨论  19-21
  结论  21-22
四、本研究创新性的自我评价  22-23
五、参考文献  23-24
六、附录  24-35
  综述  24-33
  在学期间科研成绩  33-34
  致谢  34-35
  个人简介  35

脂肪干细胞复合壳聚糖—胶原—硫酸软骨素多孔支架体外成软骨能力的实验研究

内容摘要

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