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香蕉穿孔线虫flp-14、flp-21基因克隆与特征分析

作　者: 邢丽梅
导　师: 谢丙炎
学　校: 中国农业科学院
专　业: 植物病理学
关键词: 香蕉穿孔线虫神经肽 Rs-flp-14 Rs-flp-21 原位杂交 Southern杂交
分类号: S436.68
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

植物寄生性线虫神经肌肉系统控制着线虫的入侵、取食、分泌、迁移和繁殖,类FMRF酰胺多肽(FMRFamide-like neuropeptide,FLPs)在线虫神经肌肉系统调节传递中起着重要作用。FLPs信号系统是许多防治线虫的药物的高效作用靶标,因此人们围绕线虫神经肌肉系统的重要组成部分—神经肽信号展开广泛研究,以寻找和开发新的药物靶标(Kimber et al.,2007)。无脊椎动物神经肽中最大的家族就是FLPs。本研究以香蕉穿孔线虫(Radopholus similis)为材料,用RT-PCR和RACE方法,获得了类FMRF酰胺多肽flp-14,flp-21基因的cDNA全长序列,分别命名为Rs-flp-14和Rs-flp-21,并对Rs-flp-14和Rs-flp-21基因所编码蛋白的氨基酸序列、基因组中的拷贝数、内含子及其表达特性等进行了分析。1.以香蕉穿孔线虫为材料,根据GenBank已发表的香蕉穿孔线虫flp-14和flp-21基因的EST设计引物,采用RACE技术克隆flp-14和flp-21基因的cDNA全长序列,分别命名为Rs-flp-14(GenBank登录号:FJ534855)和Rs-flp-21(GenBank登录号:AW871675)。Rs-flp-14基因cDNA序列全长为569 bp,包括一个357 bp的开放阅读框(ORF),编码含119个氨基酸的蛋白,分子量与等电点分别为12.85 KD和9.41。序列分析表明Rs-flp-14编码2个FLP肽(2xKHEYLRFG),N端具有27个氨基酸残基组成的信号肽。Rs-flp-21基因cDNA序列全长为567 bp,包括一个297 bp的开放阅读框(ORF),编码含99个氨基酸的蛋白,分子量与等电点分别为10.5 KD和9.8。序列分析表明Rs-flp-21编码1个FLP肽(AKGSRMRF),N端具有26个氨基酸残基组成的信号肽。聚类分析表明Rs-FLP-14与猪蛔虫的As-FLP-14同源,一致度最高(64%),Rs-FLP-21与秀丽杆线虫的FLP-21在同一分支,具有同源性。2.以香蕉穿孔线虫为材料,设计基因的全长引物,进行PCR扩增,结果表明Rs-flp-14基因存在三个内含子,Rs-flp-21基因存在两个内含子。根据Rs-flp-14基因序列设计引物,PCR扩增产物进行地高辛标记,获得探针。胡萝卜和线虫基因组DNA用EcoRⅠ、HindⅢ和SacⅠ限制性内酶消化,进行Southern杂交,结果表明Rs-flp-14基因以单拷贝的形式存在于植物体内。3.根据Rs-flp-14基因设计特异探针,利用原位杂交确定基因表达位置。结果显示Rs-flp-14基因表达位点在线虫的咽部的神经环处,该神经环是线虫的神经中枢,基因在此表达,说明该基因与线虫的神经系统有着密切的关系。本研究得到的有关Rs-flp-14,Rs-flp-21基因结构特性将为全面了解该类基因的功能提供有价值的信息,为研究该基因功能奠定基础,并为以FLPs为作用靶标的防治线虫药物提供理论依据。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-11
第一章绪论  11-18
  1.1 香蕉穿孔线虫及其危害  11-12
    1.1.1 生物学特性  11
    1.1.2 危害现状及防治措施  11-12
  1.2 FLPs研究概况  12-15
    1.2.1 FLPs家族简介  12-13
    1.2.2 FLPs的研究进展  13-14
    1.2.3 FLPs的功能研究  14-15
  1.3 科学问题的提出  15-16
  1.4 选题目的和意义  16-17
  1.5 技术路线  17-18
第二章香蕉穿孔线虫FLPs基因的克隆及其结构分析  18-39
  2.1 试验材料  18
    2.1.1 生物材料  18
    2.1.2 主要试剂盒  18
    2.1.3 常用试剂配制  18
  2.2 试验方法  18-21
    2.2.1 香蕉穿孔线虫的培养与分离  18-19
    2.2.2 总RNA的提取  19
    2.2.3 cDNA第一链的合成  19
    2.2.4 目的基因片段的克隆  19-20
    2.2.5 RACE获得全长cDNA  20
    2.2.6 基因序列分析  20
    2.2.7 基因内含子的扩增  20-21
    2.2.8 Rs-flp-14基因的Southern杂交  21
  2.3 结果与分析  21-37
    2.3.1 RNA的质量  21-22
    2.3.2 目的基因扩增结果  22
    2.3.3 RACE结果与分析  22-27
    2.3.4 内含子扩增结果与分析  27-31
    2.3.5 基因编码蛋白的结构分析及功能预测  31-35
    2.3.6 Southern杂交结果与分析  35-37
  2.4 小节与讨论  37-39
第三章 Rs-flp-14基因的原位杂交  39-42
  3.1 材料与方法  39
    3.1.1 试验材料及溶液配制  39
    3.1.2 香蕉穿孔线虫样品的制备  39
    3.1.3 探针标记:  39
    3.1.4 原位杂交过程  39
  3.2 结果与分析  39-41
    3.2.1 探针检测  39-40
    3.2.2 原位杂交结果分析  40-41
  3.3 小结与讨论  41-42
第四章全文结论  42-44
参考文献  44-49
附录  49-60
致谢  60-62
作者简历  62

香蕉穿孔线虫flp-14、flp-21基因克隆与特征分析

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