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一种新的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的结构和功能研究

作　者: 王俊杰
导　师: 孙树汉
学　校: 第二军医大学
专　业: 遗传学
关键词: 尖吻蝮蛇 T7噬菌体展示文库类凝血酶 HPLC 亲和纯化生物学活性
分类号: Q55
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 66次
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内容摘要

心脑血管疾病如脑中风、冠心病以及外周血管的血栓栓塞等已成为了严重影响人类健康的主要疾病。作为自然界的野生资源之一,毒蛇毒液中含有许多生物活性蛋白质和多肽,其中就包括对血液系统有重要影响的组分。利用蛇毒开发新的治疗血栓的药物,成为国内外研究的热点之一。本研究分离了广西尖吻蝮蛇毒腺组织,利用T7Select(?)Phage Display System首次构建了尖吻蝮蛇蛇毒毒腺噬菌体展示文库,以纤维蛋白/纤维蛋白原为底物,经过三轮淘选,获得了一个新的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶基因;利用生物信息学技术,分析了类凝血酶基因结构特点,构建了尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶基因的原核表达载体pET-32a-TLE,诱导表达,亲和纯化和分子筛纯化后,获得了具有生物学活性的重组蛇毒类凝血酶蛋白。本研究的主要实验结果如下:1.最先构建了广西尖吻蝮蛇毒腺噬菌体展示文库,文库滴度为2.5×10~6 pfu/ml。2.建立了使用纤维蛋白/纤维蛋白原淘选抗凝组分的方法:在固相介质上包被(ELISA板)100μl的10μg/ml纤维蛋白原后,加入扩增的噬菌体文库的裂解产物(100μl),洗去为非特异性结合的噬菌体,将特异性结合的噬菌体洗脱下来进行下一轮淘选,经过三轮“吸附一洗脱一扩增”,富集了特异性结合的噬菌体。3.获得了一个新的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶基因,基因长783 bp,能够编码260个氨基酸,GenBank Accession Number为AY861138.1,序列同源性分析,发现与GenBank登录号为AF159060类凝血酶的同源性为97%,运用互联网的http://www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl分析了此类凝血酶基团的亲疏水性,具有明显的亲水性,同源建模分析,发现其有三个结构域,信号肽,类胰岛素丝氨酸蛋白酶,内在的结构。4.构建了原核表达载体pET-32a-TLE,在0.7 mmol/L的IPTG诱导下,25℃下低温诱导表达类凝血酶蛋白,在该条件下大大降低了类凝血酶蛋白的包涵体表达,为后面简便快捷的纯化蛋白奠定了基础。重组尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的生物活性分析:血浆体外凝固实验表明,37℃下,4.4μg的重组类凝血酶使200μl血浆在65s钟内凝固;纤维蛋白原水解活性表明8μg重组类凝血酶蛋白在60分钟内可以降解纤维蛋白原的Aα链。

全文目录

中文摘要  5-6
英文摘要  6-8
缩略词表  8-9
前言  9-11
第一部分尖吻蝮蛇蛇毒毒腺噬菌体展示文库的构建、淘选及尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶基因的克隆、结构分析  11-31
  一、实验材料  12-16
  二、实验方法  16-23
  三、实验结果  23-27
  四、讨论  27-29
  五、参考文献  29-30
  六、小结  30-31
第二部分尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶基因的表达、纯化及生物活性分析  31-44
  一、实验材料  32-33
  二、实验方法  33-36
  三、实验结果  36-41
  四、讨论  41-42
  五、参考文献  42-43
  六.小结  43-44
综述  44-53
硕士期间发表论文  53-54
致谢  54

一种新的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的结构和功能研究

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