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乙型脑炎病毒E蛋白抗原表位的结构分析

作　者: 陈娜莎
导　师: 童光志
学　校: 中国农业科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: 乙型脑炎病毒 囊膜糖蛋白(E蛋白) 抗原表位 结构分析
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 125次
引　用: 2次
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内容摘要


乙型脑炎（Japanese encephalitis, JE ）是由黄病毒科黄病毒属成员日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus ,JEV）引起的一种严重危害人畜健康的虫媒病毒性疾病。囊膜糖蛋白E是JEV的主要结构蛋白,在病毒的吸附、融合、血凝、细胞趋向性、病毒毒力和诱导保护性免疫反应中起重要作用。本研究参照SA14-14-2序列,对实验室已鉴定出的6个抗原表位（E1、E11、E19、E33、E39、E49）分别从羧基端（C端）和氨基端（N端）进行逐个氨基酸的缩短,设计一系列短肽和与之对应的寡核苷酸链,退火后插入表达载体pGEX-6p-1,与GST进行融合表达,用JEV阳性血清进行Western blot分析,确定出六个抗原表位的核心序列: E1(7GNRDFIEG14)、E11(72EKRADSS89)、E19(150ENHGNYS156)、E33(259EGGLHHA265)、E39(310FAKNPVD316)和E49(385VGRGDK390)。其中, E19抗原表位( 150ENHGNYS156)完全包含于报道的线性中和表位(149SENHGNYSAQVGASQ163),因此推测E19抗原表位为具有中和活性的表位。黄病毒属（Flavivirus）是黄病毒科（Flaviviridae）的最大家族,分为8个血清学亚群,包括70多种具有血清交叉反应特性的不同病毒,如:流行性乙型脑炎、登革热病毒（Dengue fever virus,DV）、西尼罗病毒（West Nile virus, WNV）和昆津病毒（Kunjin virus,KUNV）。这些病毒均能引起发热、脑炎等相似的临床症状,但目前却没有成熟的鉴别诊断方法。本实验把E1、E10、E11、E19、E33、E39和E49七个抗原表位的核心序列与24条乙型脑炎不同病毒株和12条黄病毒属病毒不同代表株的同源序列用生物信息学软件进行了比较和分析,共设计47条突变短肽,进行GST融合表达后用免疫印迹的方法,初步确定了E1、E10、E19和E33四个抗原表位具有鉴别诊断乙型脑炎病毒与部分其他黄病毒属病毒感染的意义。本研究将为进一步分析E蛋白结构和功能、新型表位肽疫苗的研制以及建立乙型脑炎临床鉴别诊断方法奠定分子生物学基础。

全文目录


摘要  6-7
Abstract  7-13
第一章 绪论  13-24
  1.1 乙脑概述  13
  1.2 乙脑的病原学特性  13-14
    1.2.1 分类和理化性质  13
    1.2.2 血凝特性  13-14
    1.2.3 增殖特性  14
  1.3 乙脑的流行病学特点  14-15
    1.3.1 流行现状与地区分布  14
    1.3.2 传染源和传播媒介  14-15
    1.3.3 跨地区传播机制  15
  1.4 乙脑病毒的致病机制  15-16
  1.5 乙脑病毒的分子生物学特性  16-17
    1.5.1 乙脑病毒的基因组结构特点  16
    1.5.2 基因组编码产物和功能  16-17
  1.6 乙脑的诊断和防治  17-19
    1.6.1 病毒分离鉴定  17
    1.6.2 血清学诊断技术  17-18
    1.6.3 分子生物学诊断技术  18
    1.6.4 乙脑的防治  18-19
  1.7 乙脑疫苗的研究进展  19-21
    1.7.1 灭活疫苗  19
    1.7.2 减毒活疫苗  19
    1.7.3 基因工程疫苗  19-21
  1.8 乙型脑炎病毒 E 蛋白抗原表位的研究进展  21-22
  1.9 黄病毒鉴别诊断研究进展  22-23
  1.10 研究的目的和意义  23-24
第二章 乙型脑炎病毒E 蛋白抗原表位的核心序列定位  24-41
  2.1 材料  24
    2.1.1 菌种和质粒  24
    2.1.2 主要试剂  24
  2.2 方法  24-32
    2.2.1 短肽设计  24-29
    2.2.2 融合蛋白表达载体的构建与鉴定  29-30
    2.2.3 重组质粒的克隆  30-31
    2.2.4 重组融合蛋白的诱导表达  31
    2.2.5 表达产物的SDS-PAGE 分析  31-32
    2.2.6 表达产物的Western blot 分析  32
  2.3 实验结果  32-39
    2.3.1 融合蛋白表达载体的构建  32
    2.3.2 阳性重组质粒的鉴定  32-33
    2.3.3 C 端截短重组融合蛋白的 SDS-PAGE 分析  33-35
    2.3.4 C 端截短重组融合蛋白的 Western blot 分析  35-36
    2.3.5 N 端截短重组融合蛋白的 SDS-PAGE 分析  36-37
    2.3.6 N 端截短重组融合蛋白的 Western blot 分析  37-39
    2.3.7 抗原表位核心序列  39
  2.4 讨论  39-41
第三章 乙脑E 蛋白抗原表位核心序列的突变分析  41-53
  3.1 材料  41
    3.1.1 菌种和质粒  41
    3.1.2 主要试剂  41
  3.2 方法  41-46
    3.2.1 E 蛋白抗原表位核心序列的比较和分析  41
    3.2.2 突变短肽的设计  41-45
    3.2.3 重组质粒的克隆  45
    3.2.4 重组融合蛋白的表达  45
    3.2.5 表达产物的SDS-PAGE 分析  45-46
    3.2.6 表达产物的Western blot 分析  46
  3.3 实验结果  46-51
    3.3.1 乙脑病毒株E 蛋白抗原表位核心序列之间的比较  46
    3.3.2 黄病毒科不同病毒株E 蛋白抗原表位核心序列之间的比较  46-48
    3.3.3 重组质粒的克隆和重组融合蛋白的诱导表达  48-50
    3.3.4 表达产物的 Western blot 分析  50-51
  3.4 讨论  51-53
第四章 全文结论  53-54
参考文献  54-64
致谢  64-65
作者简历  65

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学
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