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去分化来源表皮干细胞的诱导及应用研究

作　者: 费阳
导　师: 田文；付小兵
学　校: 中国人民解放军军医进修学院
专　业: 外科学
关键词: 表皮干细胞 表皮细胞 诱导 去分化 创面修复
分类号: R329
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 71次
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内容摘要


目的:1.通过建立表皮细胞去分化的三种体外模型,对比三种去分化来源的表皮干细胞（dedifferention epidermal stem cells,DESCs）和原始表皮干细胞（epidermal stem cells,ESCs）的细胞形态和免疫表型,从中筛选出高效率的去分化诱导方法;2.将DESCs移植入裸鼠（BALB/c mice）背部创面,观察其对创面愈合的促进作用。方法:1.由人新鲜的包皮标本中分离获得ESCs,通过传代培养获得成熟的表皮细胞（epidermal cells,ECs）,倒置显微镜下观察两种细胞的形态、免疫组化检测细胞表型、流式细胞仪检测细胞周期及增殖指数。2.取同一包皮分离的ESCs,随机均分为5组,将其中一组ESCs作为原始表皮干细胞进行冻存待检测,其余4组进行培养传代,获得成熟的ECs。再分别以热、双氧水（H2O2）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）处理其中的3组ECs,并在处理后3d、7d、14d将3组去分化细胞与ESCs和ECs两对照组一起进行相关检测:以倒置相差显微镜观察细胞形态改变;细胞免疫组织化学观察β1整合素、CK10、CK19等表型的变化;随机选10个视野做β1整合素阳性细胞计数、统计学分析。3.建立裸鼠背部创面模型,麻醉下在每个裸鼠背部脊柱两侧制备2个直径为6mm的圆形创面,直至深筋膜,共24个创面。将24个创面随机分为DESCs、ESCs、ECs、生理盐水（normal saline,NS）组等4组,每组6个创面。分别消化离心以DAPI标记的DESCs、ESCs、ECs,加入适量NS使细胞悬液终浓度都为2×106个/ml。用1ml注射器分别将DESCs、ESCs、ECs和NS注射于相应创缘皮下及创面基底部,剂量为每个创面0.2ml。于术后0d、3d、7d统计创面面积进行统计学分析;在术后7d进行创面取材制片,荧光显微镜观察标记DAPI的DESCs、ESCs、ECs在创面的分布情况;创面取材制片行HE染色对比创面的愈合情况。结果:1.新鲜分离的ESCs小圆珠状,核大,核浆比高,细胞贴壁生长后连接成片成铺路石样,免疫组化显示其β1整合素、CK19表达呈阳性,CK10表达阴性;ECs则宽大扁平,形态不规则,核小,核浆比低,无法形成克隆,其CK10表达呈阳性,β1整合素、CK19表达阴性。ESCs处于增殖期（G2/M）的细胞比例要高于ECs。2.三种DESCs在3d、7d、14d的β1整合素阳性细胞数均高于ECs组（p＜0.01）;应用bFGF处理获得的DESCs在3d和7d的β1整合素阳性细胞数要高于其它两种处理组（p＜0.01）;三种DESCs在14d时的β1整合素阳性细胞数无明显差异（p＞0.05）,和原始ESCs相比亦无明显差异（p＞0.05）。3.创面愈合实验中DESCs组和ESCs组在术后3d和7d的创面面积均小于ECs组和NS组（p＜0.01）,DESCs组和ESCs组在术后3d和7d的创面面积则无明显差异（p＞0.05）。荧光显微镜检查发现术后7d用DAPI标记的DESCs和ESCs在皮肤和皮下组织内皆有分布,说明两种ESCs均参与了创面修复;未发现DAPI标记的ECs参与创面修复。HE染色切片显示DESCs组和ESCs组的创面愈合质量要高于两个对照组,其皮下的纤维组织较少,并发现有皮肤附属腺的再生。结论:热、H2O2和bFGF皆可诱导ECs去分化成ESCs,其中bFGF比热和H2O2在处理后3d和7d具有更高的促使ECs去分化效率;DESCs和ESCs都可促进创面修复,两者之间无明显差异。

全文目录


英文缩略词  5-6
中文摘要  6-8
英文摘要  8-10
正文  10-49
  第一部分 表皮干细胞和表皮细胞的分离、培养、鉴定  10-22
    一、前言  10
    二、实验材料  10-12
    三、实验方法  12-14
    四、实验结果  14-16
    五、讨论  16-20
    参考文献  20-22
  第二部分 不同方法诱导表皮细胞去分化的效率比较  22-38
    一、前言  22
    二、实验材料  22-24
    三、实验方法  24-26
    四、实验结果  26-33
    五、讨论  33-36
    参考文献  36-38
  第三部分 不同来源的表皮干细胞促进皮肤创面愈合的动物实验研究  38-49
    一、前言  38-39
    二、实验材料  39-40
    三、实验方法  40-42
    四、实验结果  42-45
    五、讨论  45-48
    参考文献  48-49
文献综述  49-61
攻读硕士期间发表论文  61-62
致谢  62

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体形态学 > 人体组织学
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