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CIK细胞的体内外抗肿瘤作用及回输后体内分布特点研究

作　者: 白引苗
导　师: 艾军；单保恩
学　校: 河北医科大学
专　业: 肿瘤学
关键词: CIK细胞 宫颈癌 Hela-luc细胞 IFN-γ 抗肿瘤作用 活体动物体内成像技术 体内分布
分类号: R730.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


目的:采用人宫颈癌细胞模型为研究对象。研究细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cells,CIK细胞)对人宫颈癌细胞及该细胞荷瘤小鼠的体内外抗肿瘤作用。分析将体外培养的CIK细胞回输体内后在不同组织器官的分布特点,为CIK细胞临床应用提供理论依据。方法:1 CIK细胞的制备及扩增采集健康志愿者外周血,经Ficoll密度梯度离心法收集外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC),按特定顺序加入IFN-γ、IL-2、抗CD3单抗和IL-1α,每3 d更换新鲜无血清培养基并补充IL-2,每7d测定细胞增殖反应,并绘制细胞生长曲线。经14 d培养后收集CIK细胞。2 CIK细胞表型及产生细胞因子测定用流式细胞技术检测CIK细胞表型分子的表达。用半定量RT-PCR法检测体外培养0、7、14、21、28、35 d时的CIK细胞IFN-γmRNA表达变化。3 CIK细胞的杀伤活性测定收集PBMC、体外经细胞因子诱导培养14d的CIK细胞及呈对数生长期的Hela-luc细胞,分别将CIK细胞和PBMC作为效应细胞,Hela-luc细胞作为靶细胞,以效靶比为20:1和40:1将两种细胞混合培养48 h,用MTT比色法测定CIK细胞和PBMC对Hela-luc细胞的杀伤作用。4经瑞氏-姬姆萨染色后,用光学显微镜观察CIK细胞对Hela-luc细胞作用后的细胞形态变化。5荷瘤小鼠模型的建立收集呈对数生长期的Hela-luc细胞,制成细胞悬液,调整细胞浓度为1×108/ml,于BALB/c裸鼠右侧胸背部皮下注射细胞悬液0.1ml,1×107/只,建立荷瘤小鼠模型。6 CIK细胞的体内抑瘤作用向裸鼠移植肿瘤细胞7 d后,于荷瘤小鼠的瘤旁分别注射CIK细胞(实验组)或PBS(对照组),每组6只。通过精诺真体内成像系统动态观察肿瘤大小变化及治疗效果。治疗结束后收集小鼠外周血、肿瘤组织、肺、肝、脾组织。7用ELISA法检测荷瘤小鼠外周血中IFN-γ的水平。8经HE染色,显微镜下观察肺、肝、脾的组织病理学变化以及有无肿瘤细胞浸润。9用羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记CIK细胞,经激光共聚焦显微镜观察标记情况。10 CIK细胞在荷瘤小鼠体内的分布检测通过腹腔、瘤旁分别给荷瘤小鼠注射经CFSE标记的CIK细胞,对照组不进行任何处理。分别于注射CIK细胞后3、6、12、24 h留取外周血、肿瘤组织、肺、肝、脾。将上述各待测组织剪碎,制成单细胞悬液,一部分经流式细胞技术检测各组织中CFSE标记的CIK细胞含量;另一部分进行激光共聚焦显微镜观察肿瘤组织中CIK细胞的分布情况。结果:1将人外周血单个核细胞经不同细胞因子体外培养后,诱导分化的CIK细胞在培养至第7 d时开始快速增殖,14 d时达高峰,增殖倍数最高达100倍以上。2在培养过程中,CIK细胞CD3+、CD8+、CD3+CD56+ T细胞的百分率均大幅度增加,14 d时的表达率分别为92%、42.12%、63.34%。CD3+CD56+ T细胞的百分率与最初培养当天相比(1.10%)增加57.5倍。3体外诱导培养不同时间的CIK细胞IFN-γmRNA表达水平不断增加,在14 d时达到高峰。4以20:1、40:1的比例将效、靶细胞作用48 h后,CIK细胞对Hela-luc细胞的杀伤率分别为(51.16±2.64)%、(72.14%±4.21)%。PBMC对Hela-luc细胞的杀伤率则分别为(16.33±3.09)%和(21.26±2.71)%。5经瑞氏-姬姆萨染色显微镜下可见:正常靶细胞呈菱形或多边形生长,形态饱满,细胞核染色均匀;与CIK细胞共培养的靶细胞周围有多个效应细胞围绕,形成花环状,靶细胞膜疏松,胞浆中有空泡。6注射Hela-luc细胞7 d后,在裸鼠体内全部成瘤(成瘤率达100%),成功建立了荷瘤小鼠模型。7经CIK细胞治疗4次后,荷瘤小鼠的肿瘤明显小于对照组(p<0.05),经CIK细胞治疗的第5周、第8周,对肿瘤的总抑瘤率分别为47.18%、64.38%。8 CIK细胞治疗组荷瘤小鼠外周血中IFN-γ水平(61.92±6.49)pg/ml明显高于对照组(34.30±1.78)pg/ml(p﹤0.05)。9 CIK细胞治疗组和对照组荷瘤小鼠肿瘤组织无明显形态学差异;肝脏均可见完整汇管区,未见癌结节,但有大量炎细胞浸润;脾脏均可见癌结节。CIK细胞治疗组小鼠肺脏未见癌结节,但有炎细胞浸润,对照组小鼠肺脏出现大量癌结节。10 CFSE标记的CIK细胞经腹腔注射荷瘤小鼠3 h后,可在肺、肝、脾、外周血、肿瘤中观察到绿色荧光,以肺脏的分布浓度最高(32.22%),其次是肝脏,肿瘤组织只有9.44%;注射6 h时,小鼠的肺、肝、脾脏分布浓度逐渐下降,而外周血、肿瘤组织浓度逐渐增加;注射24 h时,肿瘤组织浓度达到最高(20.56%),而肺脏浓度最低(6.73%)。11 CFSE标记的CIK细胞经瘤旁注射荷瘤小鼠3 h后,同样可在肺、肝、脾、外周血、肿瘤中观察到绿色荧光,肺脏的分布浓度最高(36.83%),其次是肿瘤组织(25.75%);注射6 h时,外周血浓度达到最高(48.02%),其他器官浓度逐渐下降;注射24 h时,外周血浓度为23.41%,肿瘤组织为13.18%,肝、脾、肺中的浓度下降到3%以下。结论:1 CIK细胞在体内外对宫颈癌Hela-luc细胞均有较强的杀伤作用,在体内能明显抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长,其作用机制可能与促进免疫细胞产生IFN-γ有关。2将CIK细胞经不同途径注射荷瘤小鼠后,可以广泛分布于全身器官,但在各脏器的分布与输注途径的不同有关。其中腹腔注射可能适用于体腔内肿瘤及恶性积液的治疗,而瘤旁注射可能适用于体表肿瘤的治疗。

全文目录


中文摘要  5-9
英文摘要  9-16
研究论文 CIK细胞的体内外抗肿瘤作用及回输后体内分布特点研究  16-72
  引言  16-18
  第一部分 CIK 细胞的体内外抗肿瘤作用研究  18-56
    前言  18-19
    材料与方法  19-29
    结果  29-31
    附图  31-45
    附表  45-46
    讨论  46-51
    结论  51
    参考文献  51-56
  第二部分 CIK 细胞在荷瘤鼠体内分布特点研究  56-72
    前言  56-57
    材料与方法  57-59
    结果  59-61
    附图  61-67
    附表  67-68
    讨论  68-69
    结论  69-70
    参考文献  70-72
综述 DC-CIK 细胞共培养后的抗肿瘤研究进展  72-86
致谢  86-87
个人简历  87

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 一般性问题 > 肿瘤治疗学
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