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TRAIL作为治疗银屑病新的药物作用靶点

作　者: 杨积顺
导　师: 胡晋红
学　校: 第二军医大学
专　业: 药理学
关键词: TRAIL 银屑病芥子气皮肤豚鼠基因真皮成纤维细胞凋亡
分类号: R758.63
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

银屑病是多基因遗传背景和环境等多因素作用下的T细胞介导的自身免疫性疾病,严重影响患者的身心健康和工作生活。近几年来,肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)又称为Apo2L ,TRAIL在皮肤增生、凋亡、炎症、免疫等疾病中的研究已成为皮肤药理学的研究热点。皮肤是过敏和炎症的频发部位,发病机制复杂,角质形成细胞和成纤维细胞等参与了反应,TRAIL与皮肤细胞的增生、分化密切相关,在调节皮肤炎症的发生发展中具有重要的作用,维持了皮肤内环境的稳定。TRAIL在银屑病发病机制中的重要作用并探索将其作为治疗新的银屑病药物作用靶点的可行性研究,将为有效治疗银屑病寻求疗效好、复发率低的新药提供理论依据。为人类攻克银屑病开辟新的研究领域和提供新的研究思路。本研究首先建立了用于检测TRAIL蛋白表达的免疫组化和Realtime PCR方法,考察了银屑病皮损、健康人皮肤、成纤维细胞中TRAIL的表达特点。研究芥子气诱导真皮成纤维细胞的凋亡及其机制。通过构建豚鼠银屑病模型,考察芥子气霜对豚鼠银屑病模型皮肤的病理改善及其治疗银屑病的可能作用机制。同时采用现代基因芯片技术,通过使用随机方差模型,筛选出银屑病病人及健康人皮肤中显著性差异基因,分别构建银屑病组与健康组差异基因的调控网络,并结合基因的功能属性,以此构建基因-基因网络,寻找银屑病发病机制中枢纽性调控基因,将其作为药物的靶基因,进行后续相关深入研究。同时考察前期证实的银屑病发病机制中可能重要的TRAIL基因在网络中的地位及其与其它相关基因的调控联系。第一部分TRAIL在银屑病皮肤和真皮成纤维细胞中的表达研究通过收集门诊典型的银屑病病人和正常人皮肤标本,应用HE病理诊断、免疫组化、real time-PCR方法明确了TRAIL在银屑病和正常皮肤中的表达差异。同时通过体外培养人真皮成纤维细胞,采用免疫组化方法明确了TRAIL受体在细胞中的表达。结果表明:1. HE染色确证了我们所选择的病例为寻常型银屑病,表现为角化过度伴角化不全,角化不全区可见Munro微脓肿,颗粒层明显减少或消失,棘层增厚,表皮突向下延伸呈钉突状;真皮乳头顶部呈杵状,其上方棘层变薄,毛细血管扩张充血,周围可见淋巴细胞和中性粒细胞等浸润。2. TRAIL在银屑病皮肤中呈阴性表达,而在正常人皮肤的表皮和真皮的交界处细胞膜及细胞质中均可见棕黄色颗粒沉淀,呈强阳性表达。表明TRAIL在健康人皮肤和银屑病病人皮肤中表达具有显著性差异。3. TRAILR1在真皮成纤维细胞上有阳性表达。4.银屑病和健康人皮肤组织均可检测到TRAILmRNA的表达,但表达亦具有显著性差异。第二部分芥子气诱导真皮成纤维细胞凋亡及分泌IL-10、TRAIL的研究本部分研究TRAIL作为治疗银屑病治疗药物新的药物作用靶点的可行性。建立了MTT、流式细胞凋亡术、免疫组织化学、ELISA等方法,考察了芥子气诱导真皮成纤维细胞凋亡规律并探讨了其分子学机制。结果表明:1.不同浓度梯度的芥子气不同程度的诱导细胞发生凋亡,抑制细胞的过度增生,各组之间的AI值和抑制细胞增生均有显著性差异(P<0.01),呈显著剂量依赖性。2.成纤维细胞在芥子气作用后,其细胞的胞膜和胞浆有TRAILR1的强表达。3.真皮成纤维细胞自身可以分泌IL-10、TRAIL,SM刺激后可以显著上调IL-10、TRAIL的表达,(P<0.05),且分泌趋势呈明显的量效和时效关系。第三部分芥子气霜对豚鼠银屑病样模型作用的研究本部分通过将5%心得安乳膏涂在豚鼠耳部背侧皮肤,构建了类似银屑病的表皮角化过度、角化不全和棘层肥厚等类似病理特征的豚鼠银屑病样模型,从整体角度考察芥子气霜用药前后HE病理染色、TRAIL表达、豚鼠血清中可溶性TRAIL分泌来研究芥子气霜治疗银屑病可能作用机制。结果表明:1.成功构建增生型的豚鼠银屑病模型,HE结果和耳缘皮肤的增厚特点确证了我们所建立的模型符合研究要求。2.芥子气霜涂敷或可溶性TRAIL因子皮下注射均很大程度上改善了银屑病病理症状,有效的抑制了表皮的过度增生和炎性细胞的浸润。3.芥子气霜和TRAIL治疗后,刺激皮肤基底层和棘层TRAIL蛋白的强阳性表达。表达部位位于胞膜和胞浆处。第四部分银屑病皮损组织基因调控网络的构建分析研究本研究利用基因芯片的数据构建了三种不同层面的网络:蛋白质与蛋白质的作用网络、基因间的调控网络和代谢网络。我们利用差异基因构建了基因-基因的调控网络图,揭示出有功能属性的基因群,及彼此之间相互关系,从一个整体基因群角度去理解银屑病发病机制,寻找银屑病发病机制中枢纽性调控基因。同时考察前期证实的银屑病发病机制中可能重要的TRAIL基因在网络中的地位及与其它相关基因的调控联系。结果表明:1.基因芯片所获得的原始数据作标准化处理,筛选出Ratio>2或<0.5的数据项共288个差异基因。2.构建银屑病组与健康组基因的表达调控网络,寻找到含MET、TRAIL、SULT1B1等的重要功能所属基因。这些基因涉及的功能有转录调节、氧化还原、电子传递,脂类代谢、硫的代谢、凋亡调控、碳水化合物的代谢。并挖掘出它们之间相互调控关系。3.比较了银屑病样本和正常样本的网络密度和聚类系数,我们发现了健康组基因的密度大于疾病组,在网络图中看到基因的相互作用关系显然是健康组大于银屑病组,凝聚度方面两个网络没有显著性差异。从聚类系数得到,两个网络中核心调控基因对其他基因的调控能力是没有显著性差异,可能正常样本基因间的调控更容易实现,网络更稳定。

全文目录

缩略词表  6-7
中文摘要  7-10
英文摘要  10-15
前言  15-18
第一部分 TRAIL 及其受体在银屑病皮肤和真皮成纤维细胞中的表达研究  18-34
  1 实验材料  18-21
  2 实验方法  21-26
  3 实验结果  26-31
  4 讨论  31-34
第二部分芥子气诱导真皮成纤维细胞凋亡及分泌IL-10、TRAIL 的研究  34-47
  1 实验材料  34-35
  2 实验方法  35-37
  3 实验结果  37-44
  4 讨论  44-47
第三部分芥子气霜对豚鼠银屑病样模型作用的研究  47-58
  1 实验材料  47
  2 实验方法  47-49
  3 实验结果  49-56
  4 讨论  56-58
第四部分银屑病皮损组织基因调控网络的构建分析研究  58-73
  1 实验材料  58-59
  2 实验方法  59-61
  3 实验结果  61-70
  4 讨论  70-73
结论  73-74
参考文献  74-80
致谢  80-81
综述肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体在皮肤疾病中的研究进展  81-89
附录硕士期间发表论文、申请专利、基金、学术会议及获奖情况  89

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