学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

A群链球菌CMCC32198的Ⅰ型胶原样蛋白与低密度脂蛋白的结合

作　者: 赵瑞东
导　师: 孙庆林；韩润林
学　校: 内蒙古农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: A群链球菌胶原样蛋白低密度脂蛋白亲和色谱 ELISA
分类号: Q93
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 10次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

A群链球菌(group A streptococcus, GAS)是致病性很强的一种链球菌,约90%的链球菌感染疾病都是由GAS引起的,其表面蛋白胶原样蛋白(Streptococcal collagen-like protein, Scl)是2000年后发现的一种GAS的致病蛋白因子,具有与胶原蛋白类似的特殊结构,分为Scl1和Scl2两种,也称为SclA和SclB。文献报道Scl可以与人的肺上皮细胞、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein, LDL)以及补体调节蛋白H因子等结合。本研究将主要探索中国医学科学院保存菌株GAS CMCC32198的Scl1是否能与人血中的LDL结合,为此类细菌引发疾病的治疗提供实验依据。本研究利用Primer D’Signer软件设计CMCC32198 Scl1及其V区的引物,通过PCR技术扩增GAS的目的基因,基因分别命名为C176和C176-v。将C176,C176-v及pASK-IBA2载体用BSAⅠ酶切后连接,构建了各自的表达载体,将重组基因转入E.Coli BL21,将阳性转化菌培养,取样进行测序分析。测序结果显示,所测序列与GenBank上基因序列号EF042101.1的已知序列同源性为100%。将阳性转化菌用去水四环素诱导表达重组蛋白C176和C176-v,用Strep-tactin纯化系统进行纯化。利用亲和色谱法(PULL DOWN实验)在人血浆中寻找C176和C176-v的配体,用SDS-PAGE技术和蛋白质免疫印迹分析技术鉴定亲和层析结果,证明其中的一种配体为LDL。通过ELISA技术检测C176和C176-v与LDL的结合能力以及GAS CMCC32198活菌与LDL的结合能力。结果证明C176和C176-v都可与LDL特异性结合,GAS CMCC32198通过表面Scl1也可以和人血浆中的LDL结合。本研究的结论是A群链球菌CMCC32198的Ⅰ型胶原样蛋白具有与人LDL结合的特性,且具有浓度依赖性。此研究结果对A群链球菌的致病机理和治疗药物的研究有一定理论意义。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-10
1 引言  10-19
  1.1 A 群链球菌胶原样蛋白  10-15
    1.1.1 A 群链球菌及A 群链球菌的致病因子  10-11
    1.1.2 A 群链球菌胶原样蛋白  11-12
    1.1.3 Scl 结构比较  12-13
    1.1.4 Scl 稳定性  13
    1.1.5 Scl 基因  13-14
    1.1.6 Scl 功能  14-15
  1.2 低密度脂蛋白  15-18
    1.2.1 脂蛋白及脂蛋白的分类  15
    1.2.2 LDL 的结构  15-16
    1.2.3 LDL 的生理作用  16-17
    1.2.4 LDL 与动脉粥样硬化  17-18
  1.3 立题依据  18
  1.4 研究内容  18-19
2 实验材料与方法  19-33
  2.1 仪器与材料  19-23
    2.1.1 主要仪器设备  19
    2.1.2 主要试剂  19-20
    2.1.3 质粒和菌株  20-21
    2.1.4 PCR 引物  21
    2.1.5 培养基  21
    2.1.6 化学贮存液  21-23
  2.2 实验方法  23-33
    2.2.1 A 群链球菌CMCC32198 基因组DNA 的提取  23
    2.2.2 DNA 的琼脂糖凝胶电泳  23-24
    2.2.3 C176-v 及C176 基因的扩增  24-25
    2.2.4 C176-v 及C176 基因扩增产物的纯化  25-26
    2.2.5 C176-v 及C176 片断的酶切及纯化  26-27
    2.2.6 pASK-IBA2 载体的酶切及纯化  27
    2.2.7 酶切 C176-v、C176 片断与pASK-IBA2 载体的连接  27-28
    2.2.8 大肠杆菌的转化  28-29
    2.2.9 菌落PCR 鉴定阳性菌落  29
    2.2.10 工程菌培养  29
    2.2.11 表达产物的SDS-PAGE 分析  29-30
    2.2.12 重组C176-v 及C176 的纯化  30
    2.2.13 蛋白含量的测定  30-31
    2.2.14 C176-v 及 C176 与血浆的 PULL DOWN 实验  31
    2.2.15 DOT BLOT 检测 PULL DOWN  31-32
    2.2.16 ELISA 检测 C176-v，C176 与 LDL 的结合  32-33
    2.2.17 ELISA 检测 A 群链球菌 CMCC32198 活菌与 LDL 的结合  33
3 结果与分析  33-42
  3.1 pASK-IBA2-C176-v 及pASK-IBA2-C176 表达载体的构建  33-38
    3.1.1 A 群链球菌 CMCC32198 基因组的提取  33-34
    3.1.2 C176-v 及 C176 基因的扩增  34-36
    3.1.3 重组载体pASK-IBA2-C176-v 及pASK-IBA2-C176 的构建  36-38
  3.2 C176-v 及 C176 蛋白的表达纯化  38-39
    3.2.1 C176-v 蛋白的表达纯化  38-39
    3.2.2 C176 蛋白的表达纯化  39
  3.3 C176-v 及 C176 与 LDL 的结合实验  39-42
    3.3.1 C176-v 及 C176 与血浆的 PULL DOWN 实验  39-40
    3.3.2 C176v 及 C176 与 LDL 结合的酶联免疫吸附实验  40-41
    3.3.3 CMCC32198 活菌与 LDL 结合的酶联免疫吸附实验  41-42
4 讨论  42
  4.1 重组蛋白C176-v、C176 的表达纯化  42
  4.2 与血浆的 PULL DOWN 实验  42
  4.3 GAS CMCC32198 与 LDL 的 ELISA 实验  42
  4.4 GAS CMCC32198 与 LDL 结合的病理生理意义  42
5 结论  42-43
6 本论文的创新之处  43-44
致谢  44-45
参考文献  45-51
作者简介  51

A群链球菌CMCC32198的Ⅰ型胶原样蛋白与低密度脂蛋白的结合

内容摘要

全文目录

相似论文