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慢性骨髓增殖性肿瘤JAK2V617F基因突变的定性及定量研究

作　者: 晁红颍
导　师: 张日
学　校: 苏州大学
专　业: 血液病学
关键词: 慢性骨髓增殖性肿瘤基因 JAK2 ARMS-PCR 突变毛细管电泳
分类号: R733.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

【背景与目的】近来研究发现,绝大多数真性红细胞增多症(PV)和半数左右的原发性血小板增多症(ET)及不明原因的骨髓纤维化(IMF)患者可存在JAK2V617F突变,上述分子事件不但对阐明慢性骨髓增殖性肿瘤(CMPN)的发病机制有重要意义,而且对于其诊断、鉴别诊断具有指导意义。鉴于JAK2V617F的发现在CMPN研究中的里程碑意义及其在CMPN中的高表达率,2008年, WHO将JAK2V617F列入PV、ET及IMF的诊断标准,并将JAK2V617F突变检测作为PV诊断的起始性步骤。进一步的研究发现,该突变存在纯合和杂合两种类型,且突变型与野生型JAK2基因的比例影响了CMPN的表型。本研究在先期研究的基础上进一步扩大样本量,动态观察了JAK2V617F突变与CMPN患者的临床特征及其并发症间的相关性;鉴于目前国内尚未见关于JAK2V617F突变分型及定量研究的文献报道,我们通过建立可行可信的ARMS(Amplification–refractory mutation sequencing)-PCR检测方法,对136例CMPN患者进行了JAK2V617F突变分型,并联合毛细管电泳定量分析了JAK2V617F突变转录本水平与与部分临床参数间的相关性,初步探讨其临床意义。【方法】第一部分:通过建立等位基因特异性PCR方法,研究了412例CMPN患者的JAK2V617F突变发生情况。412例CMPN患者均为我院2005年8月至2008年12月门诊及住院患者。按照2001年世界卫生组织(WHO)分型诊断标准,PV 114例,ET 229例,IMF 24例,慢性嗜酸性粒细胞白血病(CEL)1例,慢性中性粒细胞白血病(CNL)2例,不能分类的骨髓增殖性疾病(MPD-U) 42例。正常对照为20名健康志愿者。主要研究方法为:(1)采集患者骨髓或外周血2ml,Ficoll-paque分离单个核细胞,运用基因组DNA抽提试剂盒进行DNA的抽提;(2)采用等位基因特异性PCR技术(AS-PCR)扩增JAK2基因,扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,筛选出突变阳性患者PCR产物进行测序证实。第二部分:通过建立JAK2V617F基因突变分型及相对定量检测方法,研究136例CMPN患者的JAKV617F突变发生情况,初步探讨其临床意义。136例患者均为2003年8月至2008年6月我院就诊患者,按照2001年WHO分型诊断标准,PV 38例,ET 94例,IMF 4例,正常对照为20名健康志愿者。主要研究方法为:(1)采集患者外周血10ml,Ficoll-paque分离中性粒细胞细胞,Trizol一步法抽提总RNA,应用鼠源逆转录酶将RNA逆转录为互补cDNA;(2)建立ARMS-PCR检测技术,并通过该方法扩增JAK2基因,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳进行基因突变分型,筛选出突变阳性患者PCR产物进行测序证实;(3)通过毛细管电泳检测患者JAK2V617F突变转录本水平,定量分析JAK2V617F突变与部分临床参数间的相关性。【结果】1. 412例CMPN患者中JAK2V617F阳性277例,该突变在PV、ET、IMF及MPD-U中的的发生率分别为95.6%、55.9%、66.7%和52.4%, 2例CNL患者均检测到JAK2V617F,1例CEL患者未检出JAK2V617F。20例正常对照无一例JAK2V617F阳性。2.经过1-22个月的动态随访发现,18例JAK2V617F阳性的MPD-U患者有7例进展为典型PV,4例进展为典型ET,1例为CNL,其余6例仍不能分类;17例JAK2V617F阴性患者中2例进展为典型ET,其余仍不能分类;比较JAK2V617F阴性及阳性患者进展结果,两者差异有统计学意义(P<0.05)。3.通过ARMS-PCR法检测136例CMPN患者外周血,共检出JAK2V617F阳性96例,该突变在PV、ET及IMF中的发生率分别为97.4%、59.6%和75%;其中纯合突变在PV、ET及IMF中的发生率分别为47.3%、18.1%和25%;纯合突变在PV中的发生率高于ET(P<0.05);纯合突变者其JAK2V617F突变转录本水平为(89.5±6.0)%,高于杂合突变患者的(56.9±6.4)%(P<0.05);杂合型PV患者JAK2V617F突变转录本水平为(64.0±6.7)%,高于杂合型ET患者的(53.5±6.2)%(P<0.05)。4.JAK2V617F突变高表达组(转录本水平70%～100%)的平均年龄为(61.4±14.7)岁,高于低表达组的(53.4±12.4)岁,且两者均较JAK2V617F阴性组的平均年龄(41.6±15.8)岁为高(P<0.05);年龄>60岁者其JAK2V617F突变转录本水平为(82.6±9.4)%,高于年龄<60岁者的(60.0±6.7)% (P<0.05);JAK2V617F突变高表达组外周白细胞计数为(23.59±10.3)×109/L,高于低表达组的(13.36±7.9)×109/L,且二者均较阴性组的(9.42±4.5)×109/L为高(P<0.05)。【结论】1.中国PV、ET、IMF患者中JAK2V617F突变发生率较高,检测MPD-U患者中JAK2V617F的发生情况对疾病发展有提示作用。2.ARMS-PCR方法检测JAK2V617F基因突变及突变类型方法简便、结果可靠,联合毛细管电泳,可用于微小残留病监测。3.JAK2V617F纯合突变在PV中的发生率高于ET,JAK2V617F纯合突变的转录本水平高于杂合突变,发生JAK2V617F杂合型突变的PV患者的转录本水平高于杂合型ET。4.在经典CMPN患者中,JAK2V617F突变阳性组患者的平均年龄、外周血白细胞计数较阴性组高,年龄〉60岁患者的突变转录本水平高于年龄〈60岁者,随着JAK2V617F突变转录本水平的升高,白细胞水平也随之升高。

全文目录

中文摘要  3-6
Abstract  6-11
引言  11-23
  一、PTK 的激活与JAK2 信号传导机制  12-15
  二、JAK2V617F 突变的发现及其意义  15-20
  参考文献  20-23
第一部分 412 例骨髓增殖性肿瘤患者JAK2V617F 突变及其与临床特征间的相关性研究  23-37
  前言  23-24
  实验材料及方法  24-28
  结果  28-33
  讨论  33-35
  参考文献  35-37
第二部分慢性骨髓增殖性肿瘤患者JAK2V617F 突变定量研究的方法建立及其临床意义  37-51
  前言  37
  实验材料及方法  37-42
  结果  42-46
  讨论  46-49
  参考文献  49-51
结论  51-52
英文缩略词表  52-54
攻读学位期间公开发表的文章  54-55
致谢  55-56

慢性骨髓增殖性肿瘤JAK2V617F基因突变的定性及定量研究

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