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核苷酸类药物与小分子或蛋白质相互作用的共振瑞利散射光谱及其分析应用研究

作　者: 刘林丰
导　师: 刘绍璞
学　校: 西南大学
专　业: 分析化学
关键词: 共振瑞利散射共振非线性散射腺苷酸烟酰胺辅酶蛋白质
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

共振瑞利散射（RRS）与共振非线性散射（RNLS）是二十世纪九十年代发展起来的新的分析技术。因其灵敏度高,实验设备简单,且方法快速简便而越来越受到人们的关注。而且生物大分子的研究和测定方面更表现了它的优越性,但是目前该技术对核苷酸及烟酰胺辅酶这类生物小分子的研究甚少。因此,本文以核苷酸及辅酶为主要的研究对象,研究它们与金属离子和染料的相互作用。发展了用RRS法测定某些核苷酸和辅酶新方法。同时也研究了某些辅酶与生物大分子蛋白质之间的作用,发展了RRS法与RNLS法测定辅酶,蛋白质的新方法。文中还利用共振瑞利散射光谱,结合吸收光谱和荧光光谱的变化对相关反应机理进行了探讨。1.铈（Ⅳ）与腺嘌呤核苷酸相互作用的共振瑞利散射光谱研究及其分析应用用共振瑞利散射光谱研究了Ce（Ⅳ）与腺苷-5’-一磷酸（AMP）、腺苷-5’-二磷酸（ADP）、腺苷-5’-三磷酸（ATP）等腺嘌呤核苷酸之间的相互作用。结果表明,在pH2.0-3.0左右的Walpole缓冲溶液中,Ce（Ⅳ）及核苷酸自身的共振瑞利散射（RRS）均十分微弱,当它们相互作用形成复合物后将导致RRS显著增强并出现新的RRS光谱。不同的腺嘌呤类核苷酸与Ce（Ⅳ）结合产物具有相似的RRS光谱特征,最大散射峰均位于358 nm处并于540 nm附近有一较小的散射峰,但散射强度有一定的差异,其相对散射强度顺序为AMP＞ADP＞ATP。在_定范围内,腺嘌呤核苷酸浓度与散射强度成正比,检出限分别为2.08 ng mL^-1（AMP）、2.28 ngmL^-1（ADP）和3.63 ng mL^-1（ATP）,据此建立了一种以Ce（Ⅳ）离子为探针RRS法测定腺嘌呤核苷酸的新方法。本文讨论了Ce（Ⅳ）和腺嘌呤核苷酸反应的最佳条件及影响因素,实验了共存物质的影响,表明方法有较好的选择性。文中我们还探讨Ce（Ⅳ）与ATP的结合模式及散射增强的原因。2.烟酰胺辅酶与维多利亚蓝4R相互作用的吸收、荧光和共振瑞利散射光谱及其分析应用研究在pH7.2的Britton-Robinson（BR）缓冲溶液中,辅酶Ⅰ（NAD⁺）、辅酶Ⅱ（NADP⁺）、还原型辅酶Ⅰ（NADH）和还原型辅酶Ⅱ（NADPH）等烟酰胺辅酶与阳离子染料维多利亚蓝4R（VB4R）之间能通过静电引力和疏水作用力形成电中性离子缔合物,此时不仅能引起维多利亚蓝4R的褪色反应,而且能导致共振瑞利散射（RRS）显著增强和NADH的荧光猝灭。其最大褪色波长均位于611nm处,但褪色程度的顺序是NADPH＞NADH＞NADP⁺＞NAD⁺。4种辅酶反应产物也具有类似的RRS光谱特征,最大散射波长分别位于521nm（NAD⁺,NADP⁺）,524 nm（NADH）,526 nm（NADPH）。但它们的相对散射强度有较大的差异,并以NADPH＞NADH＞NADP⁺＞NAD⁺的顺序降低。不论吸光度降低（△A）或散射增强（△I）均在一定范围内与辅酶的浓度成线型关系。这就为用褪色分光光度法和RRS法测定这类辅酶,特别是还原型辅酶创造了条件。文中重点讨论了反应体系的RRS光谱特征,用RRS法测定辅酶的适宜条件和影响因素,并考察了共存物质对测定的影响,表明方法有良好的选择性。据此发展了一种用RRS技术高灵敏测定这类辅酶的新方法。文中还结合吸收光谱和荧光光谱的变化对反应机理和散射增强的原因进行了讨论。3.钯（Ⅱ）-辅酶-木瓜蛋白酶反应体系共振瑞利散射法测定某些烟酰胺辅酶在pH4.4-4.6的Britton-Robinson（BR）缓冲溶液中,辅酶Ⅰ（NAD⁺）,辅酶Ⅱ（NADP⁺）及还原型辅酶NADH和NADPH四种烟酰胺类辅酶能与Pd（Ⅱ）能形成1:1的螯合物,当它们进一步与木瓜蛋白酶反应形成1:1:1的三元复合物时,能引起共振瑞利散射（RRS）显著增强并出现新的RRS光谱。4种反应产物具有相似的RRS光谱特征,在300-600 nm之间有一个宽的散射带,并在309 nm和550 nm附近有两个散射峰。在一定浓度范围内,散射增强（△I）与辅酶的浓度成正比,反应具有高灵敏度。对于不同辅酶的检出限在（2.35-3.33）×10^-8mol L^-1之间,可用于微量烟酰胺类辅酶的测定。本文研究了适宜的反应条件和影响因素,考察了共存物质的影响,表明方法有较好的选择性。据此发展了一种用RRS技术灵敏,简便和快速测定上述辅酶的新方法。4.钯（Ⅱ）与还原型辅酶Ⅰ和溶菌酶相互作用的荧光和共振瑞利散射光谱研究在pH4.6BR缓冲溶液中,NADH与Pd（Ⅱ）和溶菌酶结合后,不仅能引起溶菌酶荧光光谱的显著猝灭,更能导致共振瑞利散射（RRS）的显著增强。最大RRS波长位于309 nm,其RRS增加程度与NADH的含量呈正比,对NADH的线性范围在（0.26-31.25）×10^-7mol L^-1之间,最低检出限可达5.7 ng mL^-1。而当NADH过量时,RRS的增加程度与溶菌酶的浓度在（0.035-4.2）×10^-7mol L^-1的范围内呈正比,对溶菌酶的检出限可达15.1 ng mL^-1。RRS光谱为研究生物分子与金属配合物之间相互作用提供了新的信息,也为高灵敏测定这些生物大分子与小分子创造了条件。文中还通过考察溶菌酶在NADH与Pd（Ⅱ）存在下所发生的荧光猝灭,以及NADH在溶菌酶及Pd（Ⅱ）存在下所发生的荧光猝灭,研究了它们的荧光猝灭类型,并探讨了Pd（Ⅱ）与NADH及溶菌酶的结合模式及反应机理。5.钯（Ⅱ）-NADP与几种蛋白质体系的共振瑞利散射光谱和共振非线性散射光谱及其分析应用在pH4.0-5.0的Britton-Robinson（BR）缓冲溶液中,NADP与Pd（Ⅱ）能形成螯合阴离子,它能进一步与牛血清白蛋白（BSA）、人血清白蛋白（HSA）、血红蛋白（HGB）及γ-球蛋白（γglobin）相互作用,引起共振瑞利散射（RRS）、二级散射（SOS）和倍频散射（FDS）不同程度的增加。其增加强度为牛血清白蛋白＞人血清白蛋白＞血红蛋白＞γ-球蛋白。4种蛋白质的反应产物有相似的散射光谱特征,最大的RRS,SOS,FDS波长分别位于333 nm,500 nm,250 nm附近。在一定范围内,散射强度的增加(△I_RRS,△I_SOS,△I_FDS)与各种蛋白质浓度的增加均有很好的线型关系,可用于几种蛋白质的定量测定。本文考察了适宜的反应条件及各种影响因素,并实验了共存物质的影响。基于Pd（Ⅱ）-NADP-蛋白质的散射光谱基础上,发展了一种高灵敏,快速简便测定蛋白质含量的新方法。可用于血清及尿液中总蛋白质含量的测定。

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摘要  4-7
ABSTRACT  7-11
第一章绪论  11-37
  第1节核苷酸的性质应用及主要分析方法  11-16
    1.1 核苷酸的结构  11
    1.2 腺苷酸的性质及应用  11-12
    1.3 腺苷酸的分析方法  12-16
  第2节辅酶的性质应用及主要分析方法  16-21
    2.1 辅酶的结构  16-17
    2.2 辅酶的性质及分析方法  17-21
  第3节共振瑞利散射及共振非线性散射分析应用近况及本文的主要研究内容  21-25
    3.1 共振瑞利散射及共振非线性散射分析应用近况  21-23
    3.2 本文的主要研究内容  23-25
  参考文献  25-37
第二章研究报告  37-99
  第1节铈(Ⅳ)与腺嘌呤核苷酸相互作用的共振瑞利散射光谱研究及其分析应用  37-49
  第2节烟酰胺辅酶与维多利亚蓝4R相互作用的吸收、荧光和共振瑞利散射光谱及其分析应用研究  49-63
  第3节钯(Ⅱ)-辅酶-木瓜蛋白酶反应体系共振瑞利散射法测定某些烟酰胺辅酶  63-71
  第4节钯(Ⅱ)与还原型辅酶Ⅰ和溶菌酶相互作用的荧光和共振瑞利散射光谱研究  71-87
  第5节钯(Ⅱ)-NADP与几种蛋白质体系的共振瑞利散射光谱和共振非线性散射光谱及其分析应用  87-99
致谢  99-101
攻读硕士期间所完成的论文题录  101

核苷酸类药物与小分子或蛋白质相互作用的共振瑞利散射光谱及其分析应用研究

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