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山羊CD4基因外显子6多态性与精子内化外源DNA能力的相关性研究

作　者: 范景胜
导　师: 徐恢仲；赵永聚
学　校: 西南大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖学
关键词: 山羊 精子 外源DNA SMGT CD4 PCR-SSCP
分类号: S827
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


哺乳动物精子具有自发结合内化外源DNA的能力。精子介导基因转移是转基因效率较高的技术方法之一,但同时存在着极大的随机性和不确定性。DNA的内化转运受到精子质膜分子的严格调控,仅有少量结合的DNA能被内化转运到精子细胞核,极大的降低了精子介导基因转移效率。研究发现精子供体对精子载体法制备转基因动物有显著影响,不同品种的动物精子结合内化外源DNA能力存在显著差异。本研究以精子质膜上的转运系统之一CD4分子为研究对象,通过PCR-SSCP技术分析山羊CD4基因,并与精子内化外源DNA能力进行相关性分析。（1）选取了体况、精液品质相近的南江黄羊、波尔山羊和波尔山羊×川东白山羊杂交一代羊（简称波川F1）3个品种的种公羊17只,假阴道法采集精液,离心去除精清,与地高辛标记的线性pEGFP-N1质粒共孵育,免疫组化法检测转染效率;（2）通过PCR-SSCP技术分析了南江黄羊、川东白山羊、波尔山羊和波川F1代山羊4个品种共97个个体的CD4基因外显子6序列的单核苷酸多态性;（3）对南江黄羊、波尔山羊和波川F1代山羊3个品种的种公羊CD4基因外显子6多态性与其精子内化转运外源DNA的能力进行相关性分析。主要研究结果如下:1.不同山羊品种的精子内化外源DNA的能力不同。在3个品种中,南江黄羊精子内化外源DNA的能力较高,为（35.994±1.71）%,其次是波川F1代山羊,为（32.06±3.21）%,波尔山羊最低,为（21.54±2.31）%,南江黄羊、波川F1代山羊的内化转染效率极显著高于波尔山羊（P＜0.01）。2.在选取的4个山羊品种中,发现CD4基因外显子6存在1个SNP位点。山羊CD4基因cDNA编码区700 bp处存在G/A突变,引起了234位氨基酸发生G/R突变。南江黄羊、川东白山羊检测到AA、AB和BB型3种基因型,波尔山羊和波川F1代检测到AA和AB型2种基因型。4个山羊品种的PIC、He、Ne从大到小排列是南江黄羊,川东白山羊,最后是波尔山羊和波川F1代羊。3.山羊CD4基因外显子6的SNP位点与精子内化外源DNA能力存在相关性。在所检测样本中,BB型山羊精子内化外源DNA效率最高（35.26±0.43）%,AA型和AB型山羊精子内化效率分别为（27.83±2.29）%和（29.37±3.28）%。BB型内化效率显著高于AA型和AB型内化效率（0.01≤P≤0.05）,表明山羊CD4基因外显子6的SNP位点可能是影响精子内化外源DNA能力的因素之一,其B型等位基因可能是精子内化外源DNA能力的分子标记之一。

全文目录


摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
英文缩略词一览表  11-12
第1章 文献综述  12-22
  1.1 精子介导基因转移的发展历史  13
  1.2 精子介导转基因的原理  13-16
    1.2.1 精子结合外源DNA的分子机制  14-15
    1.2.2 精子内化外源DNA的分子机制  15-16
  1.3 外源DNA在精子细胞中的存在状态及检测方法  16-17
  1.4 SMGT生产转基因动物技术途径的研究  17-18
    1.4.1 简单共孵育法  17-18
    1.4.2 脂质体介导  18
    1.4.3 电穿孔法协助  18
  1.5 精子介导转基因方法存在的问题  18-19
  1.6 CD4是目前发现的参与外源DNA转运的侯选分子之一  19-20
  1.7 精子载体法介导基因转移技术的应用前景  20-21
    1.7.1 用于制备生物反应器生产转基因药物  20
    1.7.2 用于异种器官移植  20-21
    1.7.3 用于建立转基因疾病动物模型  21
  1.8 结语  21-22
引言  22-24
第2章 材料与方法  24-38
  2.1 试验材料  24-28
    2.1.1 试验动物  24
    2.1.2 质粒与菌种  24
    2.1.3 试剂与药品  24-27
    2.1.4 试验仪器设备  27-28
  2.2 试验方法  28-38
    2.2.1 山羊精子转染外源DNA试验  28-31
    2.2.2 山羊CD4基因外显子6多态性分析  31-36
    2.2.3 山羊CD4基因多态性与精子内化外源DNA效率的相关分析  36-38
第3章 结果与分析  38-48
  3.1 山羊精子转染外源DNA试验  38-41
    3.1.1 pEGFP-N1质粒的提取、检测与标记  38-39
    3.1.2 山羊精液品质检查结果  39
    3.1.3 转染地高辛标记DNA精子免疫组化检测结果  39-40
    3.1.4 精子转染效率统计结果  40-41
  3.2 山羊CD4基因外显子6多态性分析  41-45
    3.2.1 山羊基因组DNA的提取  41-42
    3.2.2 山羊CD4基因外显子6扩增结果  42
    3.2.3 山羊CD4基因第6外显子的PCR-SSCP结果  42
    3.2.4 山羊CD4基因外显子6的SNP位点分析  42-44
    3.2.5 四个山羊品种CD4基因外显子6 SNP统计结果  44-45
  3.3 山羊CD4基因多态性与精子内化外源DNA能力的关联分析  45-48
    3.3.1 公羊CD4基因外显子6基因型频率与基因频率  45-46
    3.3.2 CD4基因与精子内化外源DNA能力的关联分析  46-48
第4章 讨论  48-54
  4.1 山羊精子转染外源DNA  48-49
  4.2 山羊CD4基因外显子6的多态性  49-52
    4.2.1 关于PCR-SSCP方法  49-50
    4.2.2 关于山羊CD4基因外显子6 SNP分析  50-51
    4.2.3 关于山羊CD4基因外显子6的遗传变异  51-52
  4.3 山羊CD4基因与精子内化转运外源DNA效率的相关性  52-53
  4.4 需要进一步研究解决的问题  53-54
第5章 结论  54-56
参考文献  56-64
致谢  64-66
在学期间发表文章  66

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家畜 > 山羊
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