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禽流感病毒和新城疫病毒双重RT-PCR检测及野鸭源禽流感病毒M基因序列分析

作　者: 刘婧君
导　师: 费荣梅
学　校: 南京农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 禽流感病毒新城疫病毒双重RT-PCR 野鸭进化树分析
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

1.本研究根据GenBank中发表的禽流感病毒和新城疫病毒的基因组序列,利用DNAStar软件分别对AIV、NDV的基因序列进行同源性比较,设计筛选出两对双重RT-PCR反应的特异性引物,其中一对是禽流感病毒的通用引物,扩增出大小约为190bp的片段;另一对为新城疫病毒的通用引物,扩增出大小约为363bp片段。分别建立了AIV、NDV的单一RT-PCR检测方法,用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物,结果证明所扩增的产物均为特异性的核酸片段。在单一RT-PCR方法的基础上,进行引物浓度、退火温度等反应条件的优化后,建立了AIV和NDV的双重RT-PCR检测方法,可以在一个PCR反应中同时扩增出禽流感病毒和新城疫病毒两种不同大小的特异性片段,并对该反应条件进行了优化。此双重RT-PCR诊断方法的敏感性要高于病毒分离方法,且缩短了检出时间,表明该方法具有高度的特异性和灵敏性,可从分子水平对禽流感病毒和新城疫病毒进行早期快速诊断和流行病学调查。2.2007年2月从江苏省盱眙县等地采集了8种野鸭泄殖腔拭子70份,RT-PCR检测结果显示14.29%(10/70)的野鸭带有A型流感病毒,其中斑嘴鸭和赤麻鸭的阳性率最高,为25%,表明江苏省越冬野鸭的流感病毒库比较庞大。通过SPF鸡胚尿囊腔接种分离病毒,得到病毒6株,病毒分离率为8.57%(6/70)。有1.43%(1/70)的野鸭带有新城疫病毒,并通过SPF鸡胚尿囊腔接种分离病毒,得到病毒1株,分离率为1.43%(1/70)。本研究分离的6株流感病毒通过RT-PCR扩增出的NS基因中大小为190bp的一段高度保守的片段,同源性为100%,与猪源的HSNl同源性为97%,在苏格兰分离的HSN1的同源性为100%,河南、山东、湖南、湖北在禽源中分离的H5N1同源性竞高达99%。野鸭可能在A型流感病毒的传播过程中起重要作用。分离的1株新城疫病毒F基因的一段为363bp的保守序列,与弱毒苗株Lasota、B1同源性为100%,与国内毒株JS/1/05/Go、SD/1/04/Go、ZJ/2000、SD/1/03/Go同源性为100%,均为鹅源。进一步证明了野生水禽在新城疫病毒的进化中有着重要的作用。3.对2004年12月到2005年3月分离的5株病毒的M基因进行了全长克隆,对M基因核苷酸序列及其两个产物的氨基酸序列与1973～2007年间分离的已发表的41株各种血清亚型的、不同地区不同宿主来源的A型流感病毒的M基因序列用MegAlign(DNAStar)序列同源性分析,用PHYlip软件绘制基因进化树进行分析,结果表明5株病毒M基因进化同源性都在95%以上,同源性高低与野鸭种类、分离地点、分离时间无关,说明野鸭中流感病毒具有多样性。本试验中spdkXY605、spdkXY705、spdkXY905、maXY704特别值得注意,此4株病毒M基因在同一进化分支上,同源性在99.5%以上。与我国国内河北、吉林等省家禽所感染的高致病性禽流感病毒H5N1亲缘关系密切,与在日本北海道鸭中分离的H5N1的亲缘关系较近。在M1、M2基因氨基酸序列比对中,发现此次分离的5株流感病毒与欧亚系流感病毒H9亚型在遗传演化地位上关系密切。可能说明江苏省越冬的野鸭可能在流感病毒传播过程中起重要作用。

全文目录

中文摘要  5-7
ABSTRACT  7-9
引言  9-10
A 篇文献综述  10-46
  第1章野生水禽在A型流感病毒进化与传播中的作用及研究进展  10-32
    1 禽流感病毒的特性  10-12
    2 宿主范围与宿主特异性  12-15
    3 野生鸟类在全球传播A型流感病毒中的作用  15-25
    4 加强对野生鸟类中A型流感病毒的监测工作  25-32
  第2章新城疫病毒的流行和毒力演变趋势及其研究进展  32-46
    1 新城疫病毒的特性  32-37
    2 新城疫病毒的流行趋势  37-38
    3 新城疫病毒毒力的演化规律  38-46
B 篇研究内容  46-90
  第3章检测禽流感病毒和新城疫病毒双重RT-PCR方法的建立  46-63
    1 材料与方法  48-52
    2 结果  52-58
    3 讨论  58-60
    参考文献  60-63
  第4章江苏省越冬野鸭中A型流感病毒和新城疫病毒的检测及病毒分离  63-77
    1 材料与方法  65-67
    2 结果  67-69
    3 讨论  69-74
    参考文献  74-77
  第5章野鸭禽流感病毒5株分离株的M基因序列分析  77-90
    1 材料与方法  78-80
    2 结果  80-84
    3 讨论  84-89
    参考文献  89-90
全文总结  90-92
附录  92-94
致谢  94

禽流感病毒和新城疫病毒双重RT-PCR检测及野鸭源禽流感病毒M基因序列分析

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