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不同倍性鱼cdc2基因cDNA部分序列的克隆及其在卵巢中的表达分析

作　者: 曾琛
导　师: 刘少军
学　校: 湖南师范大学
专　业: 发育生物学
关键词: 四倍体 三倍体 雌核发育二倍体鲫鲤 卵巢 细胞周期 核内复制 cdc2 Real-time PCR
分类号: Q953
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要


异源四倍体鲫鲤是世界上首例人工培育的两性可育的四倍体鱼，为探讨自然界多倍体的形成机制提供了非常重要的理论依据和实验材料。用雄性异源四倍体鲫鲤与雌性二倍体日本白鲫（Carassius auratus cuvieri）交配产生了具有生长优势的三倍体湘云鲫（allotriploid crucian carp）。异源四倍体鲫鲤产生的二倍体卵子经紫外线灭活的散鳞镜鲤的精子激活，获得了大量雌核发育二倍体鲫鲤后代（G1）；G1早期性腺中的卵原细胞发生减数分裂前核内复制并产生大量的二倍体卵子，这些卵子经紫外线灭活的散鳞镜鲤精子激活，获得了第二代雌核发育二倍体鲫鲤（G2）：用类似的方法，目前，已狭得了第三代雌核发育二倍体鲫鲤（G3）。该雌核发育二倍体鲫鲤克隆体系为研究核内复制分子机制提供了宝贵的实验材料。本文以这些实验鱼为材料，对细胞周期调控基因cdc2进行了一系列研究。cdc2基因最早是在裂殖酵母中发现的，研究表明，脊椎动物中cdc2基因的产物p34cdc2（即Cdc2）与cyclinB结合形成MPF并协同启动G2期向M期的过渡。本文通过3’-Race和PCR方法，获得G3、二倍体红鲫、三倍体湘云鲫、异源四倍体鲫鲤cdc2基因cDNA部分序列，并用RT-PCR及Real-time PCR方法检测不同倍性鱼卵巢中的表达水平。①cdc2基因cDNA部分序列的克降克隆获得cdc2基因cDNA部分序列，根据这些序列推导出其编码的氨基酸序列，并对同源性进行比较分析，结果发现：鱼类cdc2基因的氨基酸序列具有高度的保守性，在异源四倍体鲫鲤、三倍体湘云鲫、二倍体红鲫、G3、金鱼、斑马鱼、虹鳟鱼、日本虹鳟鱼、还有鲈鱼中，同源性为89.0-99.5％不等。其中，本实验克隆的四种鲤科鱼类（异源四倍体鲫鲤、三倍体湘云鲫、红鲫、G3）与同为鲤科的金鱼、斑马鱼同源性较高，与亲缘关系较远的虹鳟鱼、日本虹鳟鱼、鲈鱼同源性相对较低。②cdc2基因在异源四倍体鲫鲤、三倍体洲云鲫和二倍体红鲫卵巢中的表达分析RT-PCR及Real-time PCR实验结果表明：同一时期三个不同倍性鱼卵巢中均有cdc2的表达，二倍体红鲫、三倍体湘云鲫、异源四倍体鲫鲤中cdc2 mRNA的起始相对拷贝数分别为100、100.87和101.44，出现了随倍性的递增而依次升高的现象。我们推测这种现象可能与p34cdc2凝集染色体的相应功能有关。③cdc2基因在雌核发育二倍体鲫鲤（G3）和二倍体对照（红鲫）卵巢中的表达分析RT-PCR及Real-time PCR实验结果表明：雌核发育二倍体鲫鲤（G3）和二倍体红鲫的卵巢中cdc2基因mRNA的表达水平是不同的，G3中cdc2基因的表达量比二倍体对照（红鲫）明显的要高，这为进一步研究核内复制分子机制提供了一定的实验证据。

全文目录


中文摘要  3-5
英文摘要  5-10
第一章 前言  10-25
  1.细胞周期与M期调控机制的研究  10-16
    1.1.真核生物M期分子调控机制的研究  11-14
    1.2.核内复制是一种特殊的细胞周期类型  14-16
  2.Real-time PCR技术  16-22
    2.1 Real-time PCR基础知识  16-19
    2.2.Real-time PCR实验办法  19-20
    2.3 Real-time PCR的解析方法  20-22
  3.实验鱼产生的背景及研究  22-25
    3.1 异源四倍体鲫鲤产生的背景  22-23
    3.2 三倍体湘云鲫产生的背景  23
    3.3 雌核发育二倍体鲫鲤产生的背景及其产生二倍体卵子的机制研究  23-25
第二章 实验部分  25-48
  1.异源四倍体鲫鲤、三倍体湘云鲫、红鲫、G_3 cdc2基因cDNA部分序列的克隆  25-37
    1.1 材料  25-26
    1.2 方法  26-31
    1.3 结果  31-36
    1.4 讨论  36-37
  2.cdc2基因在异源四倍体鲫鲤、三倍体湘云鲫和二倍体红鲫卵巢中的表达分析  37-42
    2.1 材料  37-38
    2.2 方法  38-41
    2.3 结果  41-42
    2.4 讨论  42
  3.cdc2基因在雌核发育二倍体鲫鲤(G_3)和二倍体对照(红鲫)卵巢中的表达分析  42-48
    3.1 材料  42-43
    3.2 方法  43-44
    3.3 结果  44-45
    3.4 讨论  45-48
参考文献  48-61
附录  61-64
  附录1 实验所用试剂配方  61-63
  附录2 硕士期间撰写、发表与课题相关的学术论文  63-64
致谢  64-65

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中图分类: > 生物科学 > 动物学 > 动物遗传学
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