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MCM5基因的克隆和真核表达及其与P53相互作用的鉴定

作　者: 杨雅琳
导　师: 吴缅
学　校: 中国科学技术大学
专　业: 细胞生物学
关键词: p53 MCM5 质谱分析 蛋白质-蛋白质相互作用 GST pull-down 免疫共沉淀
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


P53曾被称为“cellular gatekeeper”(Levine, 1997)和“the guardian of the genome”(Lane, 1992) ,因为它在协调和整合细胞对多种外界胁迫因子的应答过程中发挥了重要作用。P53像一个负责处理和整合信息然后发号施令的枢纽和控制中心,根据细胞面临的胁迫刺激的种类和刺激强度的差异,启动不同的下游信号通路,从而决定细胞的应答方式,即细胞凋亡,细胞周期阻滞,细胞衰老,DNA损伤修复,细胞代谢状态改变或发生自噬。不同的胁迫刺激条件可以使p53发生不同形式的翻译后修饰变化,进而引起一系列的细胞应答反应。P53蛋白包括了N端(氨基端)富含脯氨酸的转录激活结构域,DNA结合结构域,四聚化结构域和C端(羧基端)结构域。P53应答多种胁迫条件而进行的翻译后修饰主要发生在p53蛋白分子的N端。虽然p53的某些生物学效应与转录功能无关,但p53对其靶基因的转录激活是细胞应答各种胁迫刺激的一种非常重要的方式。而p53蛋白的氨基端不仅与其转录激活有关,还参与了p53与MDM2的相互作用。除MDM2外,还有很多p53相互作用蛋白都可以影响p53的稳定性。为了寻找新的可能调节p53转录激活的蛋白,我们利用包含了人源p53蛋白氨基端60个氨基酸的融合蛋白GST-p53N60与HeLa细胞裂解液进行GST pull-down实验,通过质谱分析获得了一个新的p53结合蛋白MCM5。MCM5作为一个DNA复制调控蛋白,它是进化保守的真核细胞微小染色体维持蛋白(minichromosome maintainance)家族成员之一。这个家族蛋白(MCM2-7)可以形成一个环形异源六聚体复合物,作为DNA解旋酶参与DNA复制的起始和延伸过程。我们以HeLa的cDNA文库作为模板进行PCR,获得了全长的人源MCM5基因。并将其克隆到了pEGFP-C1和p3*flag-myc-CMV-24两个真核系统表达载体,并通过GST pull-down和免疫共沉淀实验进一步确证了p53可以和MCM2-7解旋酶复合物的调节亚基之一MCM5发生相互作用。

全文目录


摘要  4-5
ABSTRACT  5-9
第一章 文献综述  9-32
  第一节 常用的蛋白质相互作用体外检测方法  9-11
    1.1 GST pull-down  9
    1.2 Co-Immunoprecipitation  9-11
  第二节 P53 的稳定与激活  11-15
    2.1 多种刺激条件引起p53 的翻译后修饰和稳定  11-12
    2.2 P53 稳定和激活机制的经典模型  12-13
    2.3 P53 稳定与活化经典模型的补充  13-15
  第三节 MCM 蛋白家族  15-20
    3.1 MCM 家族蛋白的发现和系统进化分析  15-17
    3.2 MCM 蛋白的氨基酸序列特征  17-18
    3.3 MCM 蛋白的生物化学性质  18-19
    3.4 MCM2-7 六聚体解旋酶复合物  19-20
  第四节 MCM 蛋白功能  20-32
    4.1 DNA 复制起始  20
    4.2 MCM 蛋白参与DNA 复制起始和延伸  20-23
    4.3 MCM2-7 解旋酶的功能调控  23-27
    4.4 微小染色体维持蛋白MCM5  27-32
第二章 实验材料与方法  32-42
  第一节 实验材料  32
  第二节 常用实验技术及方法  32-42
    2.1 聚合酶链式反应  32-33
    2.2 DNA 样品的琼脂糖凝胶电泳  33
    2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备  33-34
    2.4 DNA 的酶切、回收、连接与转化  34-35
    2.5 大肠杆菌质粒DNA 的小规模提取  35
    2.6 细胞培养和瞬时转染  35-37
    2.7 收获细胞及蛋白样品制备  37
    2.8 GST pull-down 实验  37-39
    2.9 免疫共沉淀  39
    2.10 蛋白质分离的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳  39-41
    2.11 Western Blotting  41-42
第三章 结果与讨论  42-49
  第一节 GST pull-down 和质谱分析表明MCM5 是p53N60 结合蛋白  42-43
  第二节 人源 MCM5 基因的克隆和重组质粒构建  43-44
  第三节 GFP-MCM5 的真核表达  44
  第四节 GST pull-down 验证p53 与MCM5 结合  44
  第五节 免疫共沉淀验证p53 与MCM5 间的相互作用  44-45
  第六节 讨论  45-49
参考文献  49-51
致谢  51-52

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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