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食管癌中CHFR基因的甲基化与微管抑制剂敏感性的关系

作　者: 云天洋
导　师: 刘阳
学　校: 中国人民解放军军医进修学院
专　业: 胸部外科学
关键词: 食管癌基因基因表达 CHFR DNA甲基化微管抑制剂
分类号: R735.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

背景与目的：CHFR 基因(checkpoint with FHA and ring finger),是一种在人类癌症中失活的新的细胞周期检查点基因,在有丝分裂应激时,延迟染色体的凝聚,阻止细胞进入有丝分裂中前期。研究表明,在很多肿瘤中,CHFR的表达由于CpG岛甲基化而沉默,甲基化也可导致CHFR沉默的肿瘤细胞对微管抑制剂有着特殊的敏感性。本研究应用甲基化特异性PCR (MSP)法检测正常食管粘膜、食管不典型增生、食管癌组织及食管癌细胞系CHFR基因启动子区域的甲基化情况,探讨CHFR基因在食管癌中的表观遗传学调控机制：运用MSP和RT-PCR等方法分析5-aza-2-deoxycytidine (DNA甲基化酶抑制剂)处理食管癌细胞株前后CHFR基因表达和甲基化的关系；用各种化疗药物处理食管癌细胞株,通过检测细胞活性及细胞周期来分析食管癌细胞株对不同化疗药物的敏感性。方法：1、应用RT-PCR法检测CHFR基因在5-aza-dc处理前后食管癌细胞株的表达变化,进一步明确CHFR基因的表达是否受表观遗传学调控。用MSP法检测正常人食管粘膜、食管粘膜不典型增生、食管癌组织及食管癌细胞系中CHFR基因的甲基化情况。2、用紫杉醇taxanes (Tax),多西紫杉醇docetaxel (Doc),鬼臼乙叉甙etoposide (VP16),顺铂cisplatinum (CDDP),5-氮杂-2’脱氧胞苷5-aza-2’-deoxycytidine (5-aza-dc)刺激食管癌细胞株,并用CCK-8 kit检测甲基化细胞株(KYSE70, KYSE150)和非甲基化细胞株(KYSE140, KYSE450)细胞活性,根据细胞生长抑制率来判断其对化疗药物的敏感性。用流式细胞仪检测甲基化细胞株(KYSE70, KYSE150)和非甲基化细胞株(KYSE450)在5-aza-dc、Tax、Doc、VP16及CDDP处理后的细胞周期变化,进一步研究其化疗敏感性的机制。结果：应用RT-PCR法检测10个食管癌细胞株的mRNA表达,在细胞株KYSE30, KYSE140, KYSE180, KYSE450, KYSE520, TE7和SEG1中,CHFRmRNA有表达,而在细胞株KYSE70, KYSE150和KYSE510中表达缺失。为了验证CHFR的mRNA的表达是否与其甲基化相关,我们应用甲基化酶抑制剂5-aza-dc处理食管癌细胞系96h后,发现表达缺失的KYSE70, KYSE150和KYSE510的表达恢复,而先前表达的其他7个细胞株表达无变化。以上结果说明,5-aza-dc作用于细胞后,可以逆转CHFR基因的表达沉默,恢复CHFR基因mRNA的表达。MSP检测结果显示：109例食管癌组织中49例发生CHFR基因甲基化；食管不典型增生组织50例中2例发生CHFR基因甲基化；6例正常食管粘膜均无CHFR甲基化。三者相比有统计学差异(p<0.05)；结合食管癌患者临床病理资料分析,CHFR基因启动子甲基化状态与食管癌患者的性别、年龄和病理分期无关(P>0.05)。细胞活性检测：在只添加Tax和Doc实验组中甲基化细胞株KYSE70, KYSE150的细胞抑制率高于非甲基化细胞株(KYSE140, KYSE450) (p<0.05)。甲基化细胞株KYSE70, KYSE150在5-aza-dc+Tax或5-aza-dc+Doc组中的细胞抑制率低于单加Tax或Doc两组的抑制率(p<0.05),但在72 hrs测定点差异不明显。非甲基化细胞株(KYSE140, KYSE450)在5-aza-dc+Tax或5-aza-dc+Doc组中的细胞抑制率比单加Tax或Doc两组的细胞抑制率高(p<0.05)。四株细胞在5-aza-dc+VP16或5-aza-dc+CDDP组的抑制率比单加VP16或CDDP组的抑制率均高(p<0.05)。流式细胞仪检测细胞周期变化：在KYSE70和KYSE150细胞株中,单独使用Tax或Doc处理,基本没有受到阻滞的G2-M期细胞,但是使用Tax+5-aza-dc和Doc+5-aza-dc处理,G2-M期的细胞明显增多(p<0.001)。对于CHFR非甲基化的细胞株KYSE450,在Tax或Doc处理后,G2-M期阻滞的细胞上升显著。然而KYSE450在Tax+5-aza-dc或Doc+5-aza-dc处理后，G2-M期阻滞的细胞与单加Tax、Doc的细胞相比未见明显的变化(p>0.005)。结论：CHFR基因在食管癌的发生中有着重要的作用,其启动子区域CpG岛甲基化导致了CHFR的失活抑制了其表达。应用5-aza-dc处理后CHFR表达的恢复为食管癌的治疗提供了新途径。通过食管癌细胞系CHFR甲基化与化疗药物关系的研究,我们推测CHFR的甲基化与食管癌细胞对微管抑制剂化疗药物的化疗敏感性高度相关,CHFR基因的甲基化检测可能成为食管癌临床化疗中预测微管抑制剂类药物的指标。

全文目录

中文摘要  5-8
英文摘要  8-11
食管癌组织、细胞系中细胞周期检查点基因 CHFR的甲基化情况  11-35
  前言  11-13
  材料与方法  13-23
  结果  23-27
  讨论  27-31
  小结  31-32
  参考文献  32-35
食管癌细胞系中细胞周期检查点基因CHFR的甲基化情况与化疗药物敏感性的相关性  35-50
  前言  35-36
  材料与方法  36-39
  结果  39-44
  讨论  44-47
  小结  47-48
  参考文献  48-50
文献综述  50-60
  参考文献  56-60
英文缩略词表  60-61
攻读学位期间发表的文章情况  61-62
致谢  62

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