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间充质干细胞高分子量分泌成分对辐射性肠损伤的修复作用

作　者: 高志买
导　师: 范礼斌；张庆林
学　校: 安徽医科大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 间充质干细胞辐射损伤修复
分类号: R818
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

辐射损伤常发生在核爆炸、核泄漏、核恐怖及临床肿瘤病人的放疗过程中。体内代谢更新快的组织对射线最为敏感,如造血组织、肠道组织。腹部肿瘤病人接受一定剂量的照射,肠隐窝内的干细胞及肠绒毛结构都会遭到一定程度的破坏,进而导致肠粘膜结构破坏,肠道的物理屏障和免疫屏障功能不再完整,肠腔内的大量致病生物及毒性物质进入血液和体液循环,引起全身病变,严重者引起全身多器官的感染、衰竭。最后导致死亡。目前,针对放射性肠损伤的治疗仍以对症治疗为主,多种细胞因子联合应用虽然取得了一定的效果,但不是太理想,应用细胞因子的种类和组合方式也有待进一步探索优化。因此,探索促放射性肠损伤修复的有效方法具有重要的研究意义。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)最早是从骨髓中分离获得的一类独立于造血干细胞(Hematopoietic stem cells, HSCs)的成体干细胞,具有很强的自我更新和多向分化潜能,在相应的诱导环境下可以分化为中胚层来源的成骨、软骨、脂肪细胞,甚至分化为其他胚层的组织细胞。又由于MSCs的低免疫原性,MSCs被认为是最为理想的组织工程修复细胞。大量的临床实验也证明了MSCs在细胞治疗方面的优越性及可行性。移植到体内的MSCs通过什么机制发挥治疗作用,一直有几种不同的观点,(1)归巢到损伤的组织,并分化为该种组织细胞,起到组织修复的作用,(2)归巢到损伤组织,与相应的细胞融合,(3)进入体内的MSCs通过旁/内分泌的方式分泌大量的生长因子、趋化因子发挥治疗作用。已实验证实,MSCs在培养过程中产生大量的细胞因子分泌到胞外。据此我们设计了本课题:建立一个辐射性肠损伤模型,分离培养鉴定脐带源MSCs,收集处理MSCs低氧条件培养液,观察其对辐射性肠损伤的修复作用。一、小鼠辐射性肠损伤模型的建立将Balb/C小鼠麻醉固定于塑料盒内,首尾及四肢用铅砖屏蔽,分为五组,每组10只,分别给予60Coγ射线7.0Gy、8.5Gy、10.0yG、11.5Gy、13.0Gy五个剂量腹部局部照射。观察辐照后30天内各组小鼠的存活率,根据存活率、小肠病理切片及辐照后小鼠的活动表现,选择10Gy作为后续实验的照射剂量。二、脐带(umbilical cord, UC)源间充质干细胞的分离、纯化、诱导鉴定无菌收集刚出生胎儿脐带组织,去除动静脉,剩余脐带结缔组织成分,从源头上纯化细胞。将脐带剪碎成2cm3左右大小的小块,植入培养皿内,五天左右可见组织块边缘有少量贴壁的细胞爬出。换液,去除悬浮细胞,10天左右吸去组织块,待细胞长至80%融合,消化传代。传代过程中细胞得到进一步纯化,细胞呈典型的长梭型,贴壁生长,我们取3-5代的细胞诱导成骨、成脂分化。成骨诱导14天茜素红染色,镜下可见染成红色的明显的钙节节。成脂诱导第8天油红O染色,镜下可见被染成橘红色的脂滴。根据细胞形态特征及诱导分化能力,证明我们分离的细胞即为MSCs。三、MSCs低氧条件培养液的制备选3-5代MSCs接种到培养瓶中,低氧培养箱培养6小时,收集培养上清,Elisa测低氧与非低氧对照组细胞因子含量。3KD超滤管超滤浓缩,得MSCs分泌因子大分子组分。用于后续体内外实验。四、MSCs及其低氧分泌大分子成分对辐照致肠损伤小鼠的保护作用40只Balb/C小鼠按平均体重每组10只分为照射对照、MSCs、单次MSCs分泌大分子、多次MSCs分泌大分子四组。40只小鼠进行腹部局部10Gy60Coγ射线照射,照射结束1h内各组分别给予相应治疗。观察急性期内小鼠腹泻率,记录30天内小鼠的存活情况、体重变化、测小鼠外周血象。结果显示连续多次给予MSCs分泌大分子成分能明显减少小鼠腹泻,对小鼠体重及外周血也有一定的改善作用,30天内小鼠未出现死亡情况。五、小肠病理学改变实验分照射对照组、MSCs组、多次MSCs分泌大分子组,每组40只小鼠,各组小鼠接受8.5Gy60Coγ射线腹部局部照射,照后1、3、7、11、21、30、60天各时间点各组活杀5只小鼠取空肠,福尔马林固定,石蜡固定,切片,HE染色。较照射对照,多次给予MSCs分泌大分子组小肠上皮厚度明显增加,绒毛高度及完整性亦优于照射对照组。

全文目录

缩略词表  6-7
摘要  7-9
ABSTRACT  9-12
1. 引言  12-13
2 材料与方法  13-22
  2.1 实验动物及细胞来源  13
  2.2 主要试剂  13-14
  2.3 主要仪器  14
  2.4 主要试剂配制  14-16
    2.4.1 α-MEM、DMEM 培养基配制  14
    2.4.2 青链霉素溶液  14-15
    2.4.3 成骨分化诱导液  15
    2.4.4 成脂分化诱导液  15
    2.4.5 PBS 的配制  15-16
    2.4.6 茜素红染色试剂  16
    2.4.7 油红O 染色试剂  16
    2.4.8 麻醉剂（异戊巴比妥钠）的配制  16
    2.4.9 10%福尔马林固定液  16
    2.4.10 MTT 贮存液  16
    2.4.11 5000U/ml 肝素钠的配制  16
  2.5 方法  16-22
    2.5.1 血小板裂解物的制备  16-17
    2.5.2 脐带源ＭＳＣｓ的分离、纯化、鉴定  17-18
    2.5.3 MSCs 低氧条件培养液的制备  18-20
    2.5.4 MSCs 低氧条件培养液促辐照后IEC-6 增值作用  20
    2.5.5 动物实验辐照模型  20-21
    2.5.6 MSCs 及HMWF 对腹部局部辐照小鼠的治疗作用  21-22
3 结果  22-34
  3.1 脐带MSCs 的分离培养  22
  3.2 细胞原代培养生长曲线  22-23
  3.3 MSCs 分化潜能检测  23-24
    3.3.1 定向成骨分化诱导与鉴定  23
    3.3.2 定向成脂分化诱导与鉴定  23-24
  3.4 ELISA 检测MSCs 低氧条件培养液VEGF,SCF 含量  24-25
  3.5 MSCs 超滤大分子（HMWF）对辐照后IEC-6 促增值作用  25
  3.6 动物实验辐照模型  25-27
  3.7 MSCs 及HWMF 对10Gy~(60)Coγ射线局部辐照小鼠的治疗作用  27-30
  3.8 MSCs 及HWMF 治疗8.5Gy~(60)Coγ射线局部辐照小鼠病理观察  30-34
4 讨论  34-38
5. 结论  38-39
6. 参考文献  39-42
7 附录  42-43
致谢  43-44
文献综述  44-52
  参考文献  50-52

间充质干细胞高分子量分泌成分对辐射性肠损伤的修复作用

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