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增龄和不同热量饮食对大鼠肾脏自噬的影响

作　者: 崔敬
导　师: 白雪源
学　校: 中国人民解放军军医进修学院
专　业: 内科学肾脏病
关键词: 衰老自噬氧化损伤肾脏线粒体
分类号: R692
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的：目前我国已进入老龄化社会,衰老问题已成为国家与社会面临的重大问题之一。因此,急需加深对肾脏衰老机制的认识并探索延缓肾脏衰老的策略,从而减少老年肾脏疾病的发生和发展。目前认为衰老从本质上是受损和缺陷细胞成分不断在细胞内聚集,最终引起细胞和组织生理功能下降,导致机体衰老。自噬(autophagy),即自我吞噬作用(autophagocytosis),是存在于真核生物细胞中的一种高度保守的、维持细胞内环境自身稳定的重要保护性机制。在生理情况下,自噬可以清除细胞内少量受损的细胞器和大分子聚集物,因此,当自噬受损伤或自噬缺陷时,机体有可能出现衰老和衰老相关疾病。研究表明能量代谢异常与衰老的发生发展密切相关。限制热量摄入是已经得到公认的唯一可以延缓多个物种衰老速率,延长平均和最大寿命的干预方法。但是,目前对于限制热量摄入延缓衰老的分子机理还不很清楚。本研究拟通过观察3,12和24月龄Fischer 344大鼠肾脏自噬功能的改变,明确衰老对肾脏自噬功能的影响；同时探讨高热量饮食和限制热量摄入对老龄大鼠肾脏自噬功能的影响,这对于理解肾脏衰老和肾脏疾病的发生和发展机制以及探索延缓衰老相关肾脏疾病新的治疗方案具有重要的意义。方法：(1)取3月龄、12月龄和24月龄大鼠(每组10只)的肾脏组织,用PAS染色检测大鼠肾脏病理变化。用real time-PCR及Western blot,观测自噬相关基因(autophagy related genes, Atg) LC3/Atg8、beclin-1/Atg6、Atg5、Atg7,溶酶体组织蛋白酶B以及泛素结合蛋白p62/SQSTM1和多聚泛素聚集体(polyubiquitin aggregates)的表达变化。用免疫组化法观察DNA损伤产物8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)在肾组织中的定位和表达。用免疫荧光法检测8-OHdG和LC3在肾组织的定位和表达变化。分别用衰老相关β-半乳糖苷酶活性(SA-β-gal)染色方法和Western blot检测SA-β-gal活性变化和衰老标志蛋白p16。用透射电镜检测肾脏细胞线粒体的结构变化。(2)将3月龄雄性Fischer 344大鼠63只随机分为3组：①正常饮食组：26只,自由饮食饮水,；②热量限制组：16只,限制至正常食量的70%；③高热量饮食组：21只,自由进食高热量饲料。待大鼠饲养至24月龄时,处死留取24小时尿液,取血。检测血生化、肾功能(Scr、BUN)和尿蛋白/肌酐。大鼠处死时,测量大鼠体重,身长,肾重。留取肾脏组织液氮冻存,OCT包埋和10%甲醛固定。分别用于检测p16蛋白和SA-β-gal、自噬相关蛋白Atg、脂质和蛋白质氧化损伤产物丙二醛(MDA)和蛋白质羰基,8-OHdG的变化,采用PAS染色检测大鼠肾脏病理改变。结果：我们首先观察了衰老过程中肾脏自噬功能的变化。①estern blot显示,与3月龄和12月龄大鼠相比,24月龄大鼠肾脏中衰老标志物p16表达水平显著以及衰老相关β-半乳糖苷酶活性与3月龄、12月龄相比显著增加。②estern blot显示,与3月龄大鼠肾脏组织相比,24月龄大鼠自噬标志物LC3-Ⅰ随增龄显著降低,LC3-Ⅱ随增龄变化不明显。免疫荧光结果显示24月龄大鼠肾脏LC3表达显著降低。③定量PCR结果显示,在大鼠肾脏中,Atg7的表达随增龄显著降低。④estern blot结果显示,泛素结合蛋白p62/SQSTM1和多聚泛素聚集体polyubiqintin aggregates随增龄在24月龄大鼠肾脏组织中表达显著升高。Beclin-1/Atg6随增龄改变不明显。组织蛋白酶B在24月龄组大鼠肾脏中表达显著降低。⑤免疫荧光和免疫组化结果显示,在12月龄和24月龄大鼠肾脏中,DNA损伤产物8-OHdG的表达显著高于3月龄大鼠。⑥透射电镜观察显示：12月龄和24月龄大鼠的肾脏组织中,肾小管上皮细胞中线粒体出现肿胀变形和线粒体嵴结构的紊乱。⑦肾组织PAS染色显示：与3月龄相比,24月龄大鼠肾小球硬化明显。肾小管间质可见炎细胞浸润,小管萎缩。我们进一步探讨了不同热量饮食干预对肾脏自噬的功能影响。①与正常饮食组相比,高热量饮食组大鼠肾脏中p16表达显著增加,热量限制组显著降低。②与正常饮食组大鼠肾脏组织相比,高热量饮食组大鼠肾脏组织LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ显著降低,热量限制组大鼠肾组织LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ显著增高。免疫荧光结果显示热量限制组大鼠肾脏组织LC3表达高于正常饮食组,高热量饮食组LC3表达低于正常饮食组。③与正常饮食组大鼠肾脏相比,p62/SQSTM1和polyubiqintin aggregates在热量限制组大鼠肾脏组织中表达显著降低,而高热量饮食组显著升高。④免疫荧光结果显示,与正常饮食组相比,高热量饮食组8-OHdG的表达升高,热量限制组8-OHdG的表达降低。⑤氧化损伤标志物羰基和丙二醛(MDA)的检测显示,高热量饮食组显著高于正常饮食组,热量限制组显著低于正常饮食组。⑥肾组织PAS染色显示：与正常饮食组相比,高热量饮食组肾小球系膜细胞增殖程度和肾小管间质炎细胞浸润加重,热量限制组肾小球系膜细胞增殖程度和肾小管间质炎细胞浸润较轻。结论：在大鼠肾脏的自噬功能随着增龄而下降,同时伴有氧化损伤与衰老的增加。表明自噬功能受损可能在肾脏衰老的发生和发展中发挥重要作用。同时,限制热量摄入可以增强老年大鼠肾脏组织的自噬功能,减弱肾脏氧化损伤和延缓衰老；相反,高热量饮食可以抑制老年大鼠肾脏组织的自噬功能,加重肾脏氧化损伤和加速衰老。

全文目录

中文摘要  5-8
Abstract  8-10
第一部分增龄对大鼠肾脏自噬功能的影响  10-28
  前言  10-11
  材料和方法  11-18
  结果  18-25
  讨论  25-27
  小结  27-28
第二部分不同热量饮食干预对老年大鼠肾脏自噬功能的影响  28-47
  前言  28
  材料和方法  28-36
  结果  36-43
  讨论  43-46
  小结  46-47
参考文献  47-53
综述  53-76
  参考文献  64-76
在读期间发表论文情况  76-77
英文缩写词表  77-78
致谢  78

增龄和不同热量饮食对大鼠肾脏自噬的影响

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