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新型脱细胞骨基质—壳聚糖骨组织工程支架的实验研究

作　者: 刘昊
导　师: 张永刚；郭全义
学　校: 中国人民解放军军医进修学院
专　业: 外科学
关键词: 脱细胞骨基质壳聚糖支架细胞毒性试验溶血试验热原试验生物相容性骨组织工程
分类号: R318.08
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的本实验利用猪股骨制备新型脱细胞骨基质(acellular bone extracellular matrix,ABECM)材料及脱细胞骨基质-壳聚糖(Chitosan, CS)骨组织工程复合多孔支架,检测其理化性能和生物相容性,探讨其成为骨组织工程支架材料的可行性,为组织工程骨支架的研究提供实验依据。方法(1)采用Triton X-100和十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)等联合脱细胞方法对猪股骨干进行处理,对ABECM材料进行定性分析。应用溶液共混、冷冻干燥法制备脱细胞骨基质/壳聚糖(ABECM/CS)骨组织工程复合支架,对复合多孔支架进行组织学、免疫组织化学、扫描电镜、孔隙率、力学性能等特性进行检测分析。(2)分离、培养兔骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),传代后将细胞与支架复合共同培养,观察细胞的黏附、生长与增殖情况；采用MTT法观察材料浸提液于1、3、5、7天时进行细胞毒性实验观察细胞的活性；将材料浸提液与稀释血混合离心后观察红细胞溶血情况,检测OD值计算相对溶血率；将材料浸提液经静脉注入兔体内进行热原实验,在规定时间内观察兔体温变化。结果(1) ABECM材料及ABECM-CS复合支架HE染色、Hoechest33258荧光染色均无细胞残留,甲苯胺兰、蕃红O染色、茜素红染色染色阳性,Ⅰ型胶原、骨形态发生蛋白-2抗体免疫组织化学染色阳性。扫描电镜和Micro-CT显示ABECM-CS支架具有多孔结构,孔径50-200μm,孔隙率为(53.50±4.23)%,力学检测支架在干燥状态下纵向压缩模量为(33.23±14.45)Mpa,支架湿润状态下的压缩模量为(2.27±1.13)Mpa。(2)细胞-支架复合培养试验显示细胞黏附与生长良好,死活细胞染色可见支架上粘附活细胞,支架周围细胞生长活跃细胞伸出伪足相互之间连接,并有基质成分产生。细胞毒性试验显示,培养1、3、5、7天后各时间段内三组OD值两两比较(P>0.05),无显著差异,表明材料无毒性。在溶血试验中,观察实验材料的溶血率为3.0%,在生物材料标准值溶血率5%范围内,提示无溶血现象发生。热原实验结果显示每只兔体温升高均低于0.6℃,且3只兔体温升高总度数低于1.4℃,符合热原检测规定,复合材料无致热作用。结论(1)经联合脱细胞处理得到的ABECM材料与CS溶液共混、冷冻干燥法所制备的ABECM/CS复合多孔支架去细胞彻底,保留了脱细胞骨基质主要成分,具备合适的孔径和孔隙率；(2)ABECM/CS复合支架无细胞毒性、无溶血反应、无热原性,细胞-支架复合培养试验显示细胞生长与黏附良好,具有良好的生物安全性和细胞相容性,可作为构建组织工程骨的支架载体材料。

新型脱细胞骨基质—壳聚糖骨组织工程支架的实验研究

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