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磁性纳米纤维复合材料的制备及对成骨过程的作用研究

作　者: 齐晓谨
导　师: 许海燕
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 生物医学工程
关键词: 骨组织工程磁性纳米粒子纳米纤维结构再生与修复
分类号: R318.08
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

人体由于创伤、感染、肿瘤、先天畸形等各种原因引起的骨缺损及功能的丧失常需要植入替代物加以修复。虽然自体骨移植是治疗骨缺损公认的“金标准”,但会造成采骨部位的破坏,引起一些并发症；异体／异种骨和各种人工骨移植材料也都存在各自的不足之处。因此,研发理想的人工骨替代材料一直是生物材料与组织工程领域关注的重要研究方向之一。骨组织工程研究的重点是寻求能够作为细胞种植支架并引导新骨长入的生物材料,这是组织工程学研究的关键问题之一,近年来纳米结构材料已经被证实在组织工程支架方面具有重大的应用潜能。天然细胞外基质分布于细胞外空间,是由细胞分泌的蛋白和多糖所构成的纳米纤维网络,对细胞的迁移、增殖和分化等生命过程有重要的调控作用。因此,具有纳米纤维结构特征的支架能最大程度地仿生天然细胞外基质的特点,受到研究者越来越多的关注。迄今已经可以通过多种技术制备出不同材质的纳米纤维来模拟天然细胞外基质。静电纺丝技术是能够制备连续纳米长纤维的技术,所制备的无纺膜材料具有纳米纤维结构和微米尺度的孔隙,与天然细胞外基质的微观结构相似。可以通过静电纺丝技术制备成纳米纤维支架的材料主要包括天然材料、合成高分子材料、以及复合材料。聚乳酸(PLA)是一种具有良好生物相容性和生物降解特性的聚合物,在骨和软骨组织的再生与修复等骨组织工程中是细胞生长支架的基本材料。羟基磷灰石(HA)是天然骨组织的主要成分之一,具有良好的骨传导特性。直径小于20nm的氧化铁纳米粒子具有超顺磁性(magnetic nanoparticle, M-NP),能够使细胞处于多个微小磁场中。本课题采用高压静电纺丝技术制备了由PLA、HA和γ-Fe2O3-NP组成的磁性纳米纤维无纺复合膜材料,在有或无外加磁场情况下,研究了该复合膜材料的顺磁性和纳米纤维结构对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1成骨过程的影响。主要研究内容包括：筛选优化的电纺丝工艺参数,制备磁性纳米纤维无纺复合膜；通过扫描电子显微镜观察该复合膜的微观结构形貌；通过MTS试剂盒检测MC3T3-E1细胞在该复合膜上的增殖情况；通过BALP试剂盒检测该复合膜对MC3T3-E1分泌碱性磷酸酶功能的作用；通过扫描电子显微镜观察细胞在磁性纳米纤维支架材料上的矿化情况；在兔横突骨损伤模型上探讨磁性纳米纤维复合膜对骨组织损伤修复过程的影响和可能的作用机制。同时,研究了外加磁场与磁性纳米纤维材料的联合应用对体外／内骨组织的再生与修复的促进作用。实验结果表明,应用静电纺丝技术所制备的磁性纳米纤维复合膜材料具有与细胞外基质相仿的纳米纤维网络结构,纤维直径为300-600nm,孔隙直径约数微米。磁性纳米纤维复合膜能显著促进MC3T3-E1的增殖,在外加磁场存在的情况下,这种作用更加明显；对ALP分泌量的检测结果显示,在外加磁场存在的情况下,磁性纳米纤维复合膜能显著促进细胞的分化,较早开始和／或较多地分泌ALP；扫描电镜的观察显示,在外加磁场存在的情况下,磁性纳米纤维复合膜能够明显促进MC3T3-E1的矿化过程。动物实验结果显示,磁性纳米纤维复合膜能明显促进新骨的形成,联合应用外加磁场时,效果更加明显。上述研究结果为进一步研发能够引导和促进骨组织的再生与修复的细胞支架打下了良好的基础。本文还研究了渐变微纳米结构对成纤维细胞的粘附和骨架重排的调控作用。选择与组织再生与修复密切相关的成纤维细胞为研究对象,利用浇铸法制备了表面具有渐变微纳米沟槽结构的聚氨酯(PU)薄膜,作为细胞生长的基底材料；结合显微观察、MTS活细胞检测方法、细胞免疫荧光分析等手段,研究了渐变纳微米沟槽结构对细胞粘附、增殖、骨架发育、细胞伸展等生物学行为的影响。实验结果表明,微纳米沟槽结构能够促进成纤维细胞在材料表面的黏附和增殖,并诱导细胞响应所生长的微纳米沟槽结构,沿与沟槽平行的方向进行骨架重排。研究结果对于细胞支架的设计以及植入物的表面结构设计具有参考价值。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
第一章绪论  10-23
  1.1 引言  10-11
  1.2 骨组织工程  11-16
  1.3 高压静电纺丝技术  16-19
  1.4 纳米纤维结构对细胞行为的影响  19-20
  1.5 磁性纳米粒子在生物医学中的应用  20-22
  1.6 本论文的研究思路  22-23
第二章磁性纳米纤维复合材料制备和表征研究  23-34
  2.1 实验方法  23-26
    2.1.1 主要材料和试剂  23
    2.1.2 主要仪器设备  23
    2.1.3 生物材料样品的制备和性能表征  23-25
    2.1.4 纳米纤维复合材料的结构和性能表征  25-26
  2.2 实验结果  26-31
    2.2.1 纳米纤维材料和纳米粒子组分的微观形貌及结构表征  26-28
    2.2.2 纳米纤维复合材料热力学性质表征  28
    2.2.3 复合材料纳米纤维的表面化学分析  28-29
    2.2.4 磁性纳米纤维复合材料的磁学性质  29-30
    2.2.5 γ-Fe_2O_3-NP/nHA/PDLLA磁性纳米纤维复合材料的降解特性  30-31
  2.3 讨论  31-34
第三章磁性纳米纤维复合材料对细胞生长行为的影响研究  34-46
  3.1 实验方法  34-38
    3.1.1 主要材料和试剂  34
    3.1.2 主要液体配制  34-35
    3.1.3 主要仪器设备  35-36
    3.1.4 外加磁场装置  36
    3.1.5 细胞培养与鉴定  36-37
    3.1.6 细胞增殖实验  37
    3.1.7 成骨细胞骨碱性磷酸酶(ALP)检测  37-38
    3.1.8 成骨细胞体外矿化  38
    3.1.9 统计分析  38
  3.2 实验结果  38-43
    3.2.1 外加磁场强度的测定  38
    3.2.2 成骨细胞鉴定  38-39
    3.2.3 前成骨细胞在不同材料上的增殖  39-41
    3.2.4 磁性纳米纤维复合材料对成骨细胞分泌骨碱性磷酸酶(ALP)的影响  41-42
    3.2.5 磁性纳米纤维复合材料对成骨细胞矿化的作用  42-43
  3.3 讨论  43-46
第四章磁性纳米纤维复合材料的骨损伤修复动物实验研究  46-51
  4.1 实验方法  46
    4.1.1 动物来源  46
    4.1.2 实验分组  46
    4.1.3 实验材料  46
    4.1.4 器械和仪器  46
  4.2 骨移植手术  46-48
    4.2.1 术前准备及麻醉  46-47
    4.2.2 骨缺损和自体骨移植手术  47
    4.2.3 骨缺损及复合材料移植手术  47
    4.2.4 术后抗感染  47
    4.2.5 影像学检查  47-48
    4.2.6 免疫组织化学检测  48
  4.3 实验结果  48
    4.3.1 CT扫描结果  48
  4.4 讨论  48-51
第五章渐变微纳米结构对成纤维细胞生长行为的影响研究  51-59
  5.1 前言  51-52
  5.2 主要材料和试剂  52-53
  5.3 主要仪器设备  53-54
  5.4 表面具有渐变纳微米沟槽结构的聚氨酯薄膜的制备与表征  54
  5.5 小鼠成纤维细胞3T3-L1的培养与增殖实验  54
  5.6 3T3-L1细胞形态观察及骨架发育  54
  5.7 统计分析  54-55
  5.8 实验结果  55-57
    5.8.1 薄膜的纳微米沟槽结构  55
    5.8.2 细胞粘附和增殖能力  55
    5.8.3 细胞形态及骨架观察  55-57
  5.9 讨论  57-59
第六章结论与展望  59-60
参考文献  60-63
附录一:缩略词表  63-64
附录二:硕士研究生期间发表的文章和参加会议情况  64-65
附录三:非论文综述  65-73
致谢  73-74

磁性纳米纤维复合材料的制备及对成骨过程的作用研究

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