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转外源抗菌肽基因鱼腥草的稳定性及抗病性分析

作　者: 易浪
导　师: 董燕
学　校: 广州中医药大学
专　业: 中西医结合基础
关键词: 鱼腥草抗菌肽转基因稳定性抗病性
分类号: S567.239
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

鱼腥草(Houttuynia cordata Thunb.)为三白草科蕺菜属植物蕺菜的全草,具有清热解毒、消痈排脓、利尿通淋等功效,用于痰热喘咳、热痢、热淋、痈肿疮毒等症。在滇黔一带,人们常当作食品享用,被称为“既是食品,又是药品”的中药。但大面积人工栽培后,由于生长环境发生改变,其抗病虫害能力有所降低,病虫害发生普遍且较严重,直接影响了鱼腥草的质量和产量。抗菌肽(antimicrobial peptides, AP)是一类小分子的阳离子抗菌活性肽,对细菌有很强的杀伤作用,某些抗菌肽对部分病毒、真菌、原虫和癌细胞等有杀灭作用,且能提高免疫力、加速伤口愈合过程。目前已有将抗菌肽基因应用于基因工程抗病育种的相关报道。本实验室自行设计合成的昆虫抗菌肽cecropin B和兔防御素NP-1融合基因(cecropin B/NP-1),它们编码表达的蛋白在结构特点和作用机理上有所不同,可能发挥协同作用而表现出更强的抗菌能力。本文以鱼腥草为材料,对农杆菌EHA105介导的鱼腥草遗传转化方法进行了优化,获得了EHA105介导的转基因鱼腥草。初步分析由农杆菌LBA4404介导获得的转基因鱼腥草植株的外源基因的稳定性,进一步在蛋白质水平上运用Western blot检测分析外源蛋白的表达,通过抗病性研究分析外源抗菌肽的活性。主要结果如下：1.EHA105介导的转基因鱼腥草的获得农杆菌菌株EHA105毒力强,是目前常用的农杆菌转化菌株,但是应用在鱼腥草的遗传转化中,转化效果一直不理想,为了解决这一问题,本实验室在已建立的遗传转化方法的基础上,进一步优化转化方法,以提高转化率并获得稳定表达的转基因鱼腥草植株。本实验以鱼腥草为受体材料,对潮霉素筛选浓度进行优化,确定潮霉素最佳筛选浓度为1.5mg/L,在该筛选浓度下获得存活时间较长的转基因抗性芽,对获得的6株抗性植株进行快速PCR检测,结果表明,获得的6株抗性植株均呈阳性。2.转基因鱼腥草的筛选及外源基因稳定性的初步研究本实验室已构建的表达载体LBA4404/pBI121-CN上包含卡那霉素抗性标记基因和外源抗菌肽基因,本实验以选择培养基上生长的转基因鱼腥草为材料,通过卡那霉素(Kan)叶片涂抹法进一步筛选抗性植株,并进行卡那霉素抗性基因nptⅡ和目的基因CN (cecropin B/NP-1)的PCR分析。研究发现,Kan叶片涂抹法筛选的最佳浓度为5000mg/L,观察时间以4天为宜；经PCR检测验证, Kan抗性植株的nptⅡ基因阳性检测率达到96%,其中目的基因CN阳性率为37%。本实验建立了适用于转基因鱼腥草的快速筛选方法,同时发现在转基因鱼腥草中目的基因CN的稳定性低于抗性基因。3.转基因鱼腥草中外源抗菌肽的表达及抗病性研究本实验通过SDS-PAG电泳和Western blot方法检测转基因鱼腥草植株中外源抗菌肽的表达。同时,通过提取鱼腥草蛋白提取液进行抑菌圈实验和接种不同浓度的立枯丝核菌孢子,通过比较转基因植株与非转植株染病情况来分析外源抗菌肽的活性。结果可见转基因鱼腥草的SDS-PAG电泳结果在8KDa附近较非转出现了一条带,进一步的蛋白印迹亦可见特异性显影。活性分析结果显示,转基因鱼腥草蛋白粗提液抗细菌能力较非转得到提高；同时发现立枯丝核菌的最佳侵染孢子浓度为3×105/mL,观察时间以3天为宜,转基因鱼腥草较非转基因鱼腥草的抗茎腐病能力增强,表明外源抗菌肽的表达能增强转基因鱼腥草植株的抗茎腐病能力。4.转基因与非转基因鱼腥草的形态学比较本实验在研究中发现,转基因植株与非转植株在表观形态学上存在一定的差别,转基因植株较非转出现叶片卷曲、皱缩的改变,此外还有叶片变薄,叶柄增粗的改变；表皮细胞临时装片结果可见,转基因鱼腥草表皮细胞较非转要小,排列也较紧密,而在植物组织的石蜡切片中并未发现转基因与非转植株之间存在明显的差异。结论：通过对在抗性培养基上生长良好的转基因植株进行Kan叶片涂抹筛选,建立了一种快速简便的筛选方法,同时发现在转基因鱼腥草中目的基因CN的稳定性低于抗性基因。通过在蛋白水平的鉴定,表明外源抗菌肽蛋白在转基因鱼腥草中得到表达,并增强了转基因鱼腥草的抗病性。研究发现转基因鱼腥草植株与非转植株在表现形态学上存在一定的差异,为进一步研究外源基因的插入对鱼腥草基因组的影响及其非预期效应的产生提供理论和实验依据。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-11
引言  11-13
第一部分研究背景及立题据  13-27
  研究背景  14-26
    1. 影响外源蛋白表达的因素  14-17
    2. 检测外源蛋白的方法  17-22
    3. 转入外源蛋白对基因组的影响  22-24
    4. 转基因植物中外源基因的稳定性  24-25
    5. 鱼腥草病虫害  25-26
  立题依据  26-27
第二部分实验研究与结果分析  27-71
  第一章 EHA105介导的转基因鱼腥草的获得  28-38
    1. 材料与方法  28-35
      1.1 实验材料  28-33
      1.2 实验方法  33-35
    2. 结果与分析  35-36
      2.1 不同浓度潮霉素对外植体活性的影响  35
      2.2 农杆菌EHA105介导的遗传转化  35-36
      2.3 转基因抗性植株的快速鉴定  36
    3. 讨论  36-37
    4. 小结  37-38
  第二章转基因鱼腥草的筛选及外源基因稳定性的研究  38-51
    1. 材料与方法  38-45
      1.1 实验材料  38-41
      1.2 实验方法  41-45
    2. 结果与分析  45-48
      2.1 Kan筛选浓度和时间的确定  45-46
      2.2 Kan叶片涂抹法筛选结果  46
      2.3 两种方法提取DNA的电泳比较  46-47
      2.4 PCR检测标记基因nptⅡ  47-48
      2.5 PCR检测目的基因CN  48
    3. 讨论  48-50
    4. 小结  50-51
  第三章转基因鱼腥草中外源抗菌肽的表达及抗病性研究  51-64
    1. 材料与方法  51-58
      1.1 实验材料  51-54
      1.2 实验方法  54-58
    2. 结果与分析  58-62
      2.1 鱼腥草总蛋白的SDS-PAG电泳  58-59
      2.2 转基因鱼腥草Western blot检测结果  59-60
      2.3 抑菌圈实验结果  60
      2.4 转基因鱼腥草的抗病性  60-62
    3. 讨论  62-63
    4. 小结  63-64
  第四章转基因与非转基因鱼腥草的形态学比较  64-71
    1. 材料与方法  64-67
      1.1 实验材料  64-66
      1.2 实验方法  66-67
    2. 结果与分析  67-69
      2.1 表观形态学比较  67-68
      2.2 微观形态学比较  68-69
    3. 讨论  69-70
    4. 小结  70-71
第三部分结论与展望  71-73
  1. 结论  72
  2. 展望  72-73
参考文献  73-78
附录  78-81
  附录1 英文缩写  78-80
  附录2 研究生在校期间发表论文情况  80-81
致谢  81

转外源抗菌肽基因鱼腥草的稳定性及抗病性分析

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