学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

H5亚型禽流感病毒NP中鸡MHC限制性CTL表位的预测及鉴定

作　者: 侯艳霞
导　师: 王靖飞
学　校: 中国农业科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: 禽流感病毒核蛋白同源模建 T细胞表位
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 79次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

禽流感是由禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)引起的禽的一种高度传染病。AIV中节段5编码的核蛋白(Nucleoprotein, NP)上含有大量的细胞毒性淋巴细胞识别的抗原表位,其诱导的特异性的细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte, CTL)反应在不同亚型的AIV之间具有一定的交叉保护力。目前许多关于流感病毒的T细胞表位在人和鼠中已获得鉴定。然而,由于禽主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex, MHC)的结构和功能方面研究很少,已鉴定的禽流感病毒结构蛋白中鸡MHC限制性T细胞表位非常有限,限制了禽类抗流感病毒细胞免疫研究的开展。为鉴定H5亚型禽流感病毒NP中能被鸡MHC分子特异性识别的CTL表位,本研究首先模建了B4、B12、B15和B19单倍型鸡的MHC I类分子的α1和α2结构域的三维结构,并分析了各个单倍型结构的肽结合槽的表面性质。结果显示:结合槽的表面都高度疏水;结合槽内B口袋比F口袋的柔性大;B4单倍型的结合槽表面大部分区域带正电,B15和B19的结合槽表面以负电荷聚集为主,B12的表面相对呈中性。将AIV代表毒株A/Goose/Guangdong/1/1996 (H5N1)的NP蛋白截取重叠肽,选出符合B4、B12、B15和B19单倍型MHC I类分子结合基序的多肽,利用分子对接方法将多肽与相应的MHC I类分子结构对接,预测可以和各单倍型具有高亲和力的多肽。经以构象和打分函数相结合的方法筛选,最终获得25条(其中结合B4、B12、B15和B19的多肽数分别为10、6、2和7)与各个单倍型的MHC I类分子结合较好的潜在CTL表位肽,并选出结合能最高的9条短肽用于实验室免疫原性检测。为了诱导SPF鸡产生针对AIV NP的记忆性T细胞,本研究将优化成鸡偏嗜性的NP基因双酶切后亚克隆到含禽源启动子的真核表达载体pCAGGS中,构建重组质粒pCAGGS-NP,经筛选鉴定正确的阳性重组质粒转染293T细胞,间接免疫荧光和Western blot检测表明NP蛋白在真核细胞中能正确表达并具有良好的免疫原性。重组质粒pCAGGS-NP以100 ug/羽的剂量腿部肌肉免疫3周龄SPF鸡,3周后以同样的剂量加强免疫,间接酶联免疫实验检测结果显示pCAGGS-NP能诱导SPF鸡产生针对AIV NP的抗体,抗体水平在加强免疫后迅速升高。取加强免疫三周后的鸡脾脏制成淋巴单细胞悬液,调整细胞浓度为1×106 /mL,一部分细胞加入上述9条短肽和1条不相关肽进行体外刺激培养,24 h后收集细胞,采用ELISA试剂盒检测培养上清中IFN-γ分泌量;一部分细胞加入CFSE贮存液和10条合成肽体外培养,5 d后用流式细胞术对培养后细胞中CD8~+T淋巴细胞增殖情况进行检测。检测结果一致显示肽NP89-97(PKKTGGPIY)和NP198-206(KRGINDRNF)能刺激活化的鸡脾淋巴细胞IFN-γ分泌量明显增加,CD8~+T淋巴细胞分别有13.7 %、11.9 %的增值,表明NP89-97和NP198-206能诱导较强的细胞免疫反应,为AIV NP的T细胞表位。本研究所构建的鸡MHC I类分子的结构及鉴定的表位为进一步探讨AIV所引起的细胞免疫及T细胞表位的鉴定奠定了基础。

H5亚型禽流感病毒NP中鸡MHC限制性CTL表位的预测及鉴定

内容摘要

全文目录

相似论文