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Pluronic修饰的聚阳离子非病毒基因载体的构建、表征及体外转染效率评价

作　者: 王翔
导　师: 高申；丁雪鹰
学　校: 第二军医大学
专　业: 药剂学
关键词: 基因传递系统聚乙烯亚胺聚酰胺胺普朗尼克转染
分类号: R450
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

基因治疗是通过载体将目的基因传递到特定的组织细胞(靶细胞)内进行适当表达以治疗疾病的方式。目前基因治疗的载体分为病毒型载体和非病毒型载体。非病毒载体以其靶向性、低免疫原性、低成本、易规模化等病毒载体所没有的显著优而具有更好的临床应用前景,而在非病毒载体中,阳离子聚合物载体在基因转移方面呈现出了显著的优势。通过对阳离子非病毒载体的修饰,可以有效地屏蔽阳离子表面的正电荷,降低复合物的毒性,达到长循环的目的。目前,常用亲水性的材料对载体进行修饰,最常用的修饰剂是聚乙二醇(PEG),而普朗尼克(Pluronic)作为一种表面活性剂,富含亲水亲油基团,可以降低复合物毒性和提高对细胞的亲和性,目前对Pluronic修饰的阳离子聚合物载体研究报道较少,更没有系统地评价。本课题通过对PEI、PAMAM两种常用的载体的Pluronic修饰,考察它们的细胞毒性和转染效率,并与PEG化的材料做系统的比较,希望得到一种或者几种优于PEG修饰的Pluronic修饰的载体材料,为基因递释系统的研究提供支持。本文第一部分我们对Pluronic(型号P123)的末端羟基进行了活化,使用的是琥珀酰亚胺酯法,最后得到了活化率高,反应活度大的产物。使用活化后的聚合物按不同比例对PEI和PAMAM进行修饰。经过纯化干燥处理,得到了一系列不同修饰度的聚合物(每个PEI或PAMAM分子上分别接枝1个、2个、5个、10个PluronicP123)。同时,也合成了PEG化的上述聚合物。1H-NMR结果显示,本方法合成的阳离子聚合物接枝率高,定量控制投药量对PEI或PAMAM进行修饰,可以使其接枝率与反应时投药量的摩尔比呈良好的线性关系,说明该合成方法比较稳定、可靠,产率高。另外,1H-NMR图谱分析中未见其它杂质峰,也进一步证明这些阳离子聚合物的纯度较高。本文第二部分则考察了阳离子接枝聚合物/DNA复合物的相关性质。从凝胶电泳阻滞分析结果可以看出,完全阻滞DNA所需的N/P值随着聚合物修饰度的增加而增大,随着修饰物分子量的减小而减小。粒径结果显示,本实验所制备的复合物粒径在60-300 nm范围内。随着复合物N/P值的增加,粒径有减小的趋势。高分子量的修饰物,在高修饰度时复合物的粒径明显增大。复合物的zeta电位随N/P值的增加而增加;在相同N/P值情况下,复合物zeta电位随P123或PEG接枝数的增加而减少。第三部分评价了阳离子接枝聚合物/DNA复合物细胞毒性以及体外转染效果。MTT法测定了聚合物细胞毒性。结果表明,使用PEG或P123修饰PEI或PAMAM可以不同程度的降低其细胞毒性,在低浓度时每个PEI或PAMAM接枝一个表面活性剂的分子即可显著降低细胞毒性,但总的来说,P123修饰的PAMAM毒性远远低于P123修饰的PEI,从修饰基团的角度来说,P123与PEG修饰的复合物在相同修适度的情况下,毒性相当。选用了两种分别编码绿色荧光蛋白和虫荧光素酶的质粒。阳离子接枝聚合物/DNA复合物在HepG2细胞上的转染效果表明,低修饰度的PEI或PAMAM的最佳转染效果相对于未修饰的PEI或PAMAM并没有减少。随着修适度增加,其最佳转染效率也随之下降。在相同修饰度下,相比于PEG修饰的PEI和PAMAM,P123修饰的同种聚合物转染效率略高。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-10
前言  10-14
  主要参考文献  12-14
第一部分 PEI和PAMAM的修饰和表征  14-31
  一仪器与材料  14-15
    （一）材料  14-15
    （二）仪器  15
  二实验方法和结果  15-23
    （一）溶剂无水化处理  15-16
    （二）普朗尼克的活化  16-19
    （三）聚乙烯亚胺及聚酰胺胺的修饰  19-20
    （四）接枝聚合物的接枝率和分子量的测定  20-23
  三讨论  23
  四小结  23-31
第二部分 Graft/DNA 复合物的制备及性质考察  31-54
  一、材料与仪器  31-32
    （一）材料  31
    （二）仪器  31-32
  二、实验方法和结果  32-53
    （一） Graft/DNA复合物的制备  32
    （二）凝胶电泳阻滞分析  32-36
    （三）复合物粒径和zeta电位测定  36-39
    （四）复合物细胞毒性测定  39-53
  三、讨论  53
  四、小结  53-54
第三部分 Graft/DNA 复合物的体内外转染效果评价  54-68
  一、材料与仪器  54-55
    （一）材料  54-55
    （二）仪器  55
  二、实验方法和结果  55-67
    （一）质粒DNA的抽提和纯化  55-57
    （二）体外细胞转染实验  57-67
  三、讨论  67
  四、小结  67-68
全文总结  68-69
参考文献  69-73
文献综述  73-85
  参考文献  81-85
致谢  85

Pluronic修饰的聚阳离子非病毒基因载体的构建、表征及体外转染效率评价

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