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ADDLs体外诱导SH-SY5Y细胞自噬的研究

作　者: 郭舒涵
导　师: 何金生；张莹
学　校: 北京交通大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 阿尔茨海默病 ADDLs 自噬 LC3B mTOR
分类号: R749.16
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)的典型病理表现出现之前,“自噬”已经广泛存在。在这一阶段,β淀粉样蛋白(amyloidβ-peptide, Aβ)衍生的可扩散性配体(Aβ-derived diffusible ligands, ADDLs)是核心致病因子。但是它与AD“自噬激活”的关系尚未明确。本研究旨在明确ADDLs体外诱导神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞自噬激活的效应,并初步探讨其作用机制。从以下三方面开展工作：1) ADDLs体外对SH-SY5Y自噬的激活作用。参照相关文献制备ADDLs,并对其进行性质鉴定。用免疫印迹(western blot, WB)检测不同剂量和不同作用时间ADDLs诱导自噬激活的标志物(marker)微管相关蛋白-Ⅰ(microtubule-associated protein light chain 3, LC3)-Ⅰ和LC3-Ⅱ的表达情况；以上实验用cAMP作为自噬诱导的阳性对照。2)研究ADDLs二级结构对SH-SY5Y自噬的激活的影响。制备不同二级结构的ADDLs,利用圆二色谱仪对不同二级结构的ADDLs进行具体数据分析,计算其中α螺旋和β折叠的含量。用WB检测不同二级结构对ADDLs诱导LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的影响；用免疫荧光检测LC3的细胞定位；用Lyso-tracker示踪和吖啶橙染色观察溶酶体激活情况。3)研究ADDLs诱导SH-SY5Y自噬的通路。检测哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)激活情况,通过检测其底物p-p70、总p70(t-p70)以及p-p70/p70(t-p70)比值,来判断ADDLs诱导自噬的细胞通路。结果发现：1) ADDLs体外诱导SH-SY5Y自噬的激活作用具有时间和剂量依赖性。时间为0 h、12 h、和24 h时,ADDLs诱导LC3表达量依次升高,在作用48 h时,LC3表达量开始下降；剂量为0μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L和40μmol/L时,诱导LC3表达量逐渐增加,当剂量增加到80μmol/L时,LC3表达量开不再增加。2) ADDLs在组装过程中出现二级结构的变化,这种变化可诱导SH-SY5Y细胞的自噬激活,聚合时间为12～24 h时,α螺旋含量下降至4.5%,β折叠的含量增加至13.9%,在此期间内,可以检测到LC3表达量增加,以LC3-Ⅱ增加更明显。免疫荧光结果显示颗粒状“自噬小体”形态特征出现,以聚合24 h的ADDLs样品作用效果为明显,伴随Lyso-tracker阳性标记和吖啶橙着色颗粒的增加。3)在0-24 h范围内,随作用物聚集时间的延长,p-p70水平下降、总p70(t-p70)变化不明显,p-p70/p70(t-p70)比值下降,说明mTOR的活性被抑制,提示ADDLs诱导SH-SY5Y细胞自噬与mTOR途径相关。综上所述,ADDLs的作用时间、剂量和二级结构变化决定了SH-SY5Y细胞的自噬激活,具有LC3-Ⅱ阳性反应,并且与mTOR的抑制有关。本研究为进一步探讨ADDLs在AD“自噬激活”中的作用提供实验基础。

全文目录


致谢  5-6
摘要  6-8
ABSTRACT  8-12
1 引言  12-17
  1.1 背景与意义  12
  1.2 AD自噬研究现状与问题  12-15
    1.2.1 自噬的发现  12-13
    1.2.2 自噬的分子机制  13-14
    1.2.3 自噬的信号转导途径  14
    1.2.4 AD与自噬  14-15
  1.3 我们的研究策略  15-17
2 材料与方法  17-28
  2.1 材料  17-19
    2.1.1 主要试剂及耗材  17-18
    2.1.2 细胞  18
    2.1.3 实验仪器  18-19
  2.2 方法  19-28
    2.2.1 技术路线  19-20
    2.2.2 培养基及溶液的配制  20-22
    2.2.3 细胞培养  22-23
    2.2.4 ADDLs的制备和鉴定  23
    2.2.5 负染和透射电镜  23-24
    2.2.6 SDS-PAGE  24
    2.2.7 ADDLs的CD谱分析  24
    2.2.8 自噬的诱导  24-25
    2.2.9 细胞总蛋白的提取  25-26
    2.2.10 Western blot检测  26
    2.2.11 间接免疫荧光  26-27
    2.2.12 溶酶体的示踪与检测  27-28
3 实验结果  28-43
  3.1 ADDLs体外对SH-SY5Y细胞的自噬激活作用  28-30
    3.1.1 剂量依赖性  28-29
    3.1.2 时间依赖性  29-30
  3.2 ADDLs二级结构对SH-SY5Y细胞自噬激活的影响  30-41
    3.2.1 ADDLs寡聚体的制备  30-31
    3.2.2 ADDLs形态  31-32
    3.2.3 圆二色谱仪检测ADDLs寡聚体的二级结构  32-33
    3.2.4 ADDLs二级结构的变化诱导SH-SY5Y细胞的自噬激活  33-41
  3.3 ADDLs诱导自噬的通路  41-43
4 讨论  43-47
  4.1 ADDLs及其二级结构特性  43-44
  4.2 ADDLs二级结构与自噬标志物以及溶酶体的联系  44-45
  4.3 ADDLs诱导自噬与mTOR相关,但不排除其它途径  45-47
5 结论  47-48
参考文献  48-51
附录A  51-53
作者简历  53-55
学位论文数据集  55

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中图分类: > 医药、卫生 > 神经病学与精神病学 > 精神病学 > 脑器质性精神障碍 > 老年及早老性精神障碍
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