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HBx转染小鼠细胞因子的表达及GST-MIG，GST-IP-10融合蛋白原核表达载体的构建与表达

作　者: 孙丽芳
导　师: 沈关心
学　校: 华中科技大学
专　业: 免疫学
关键词: 乙型肝炎病毒 HBx microarray 趋化因子 MIG IP-10
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

【目的】采用高压水动力尾静脉注射HBx建立动物模型,通过microarray分析细胞因子表达的差异,为探讨表达差异最为显著的趋化因子在HBV感染中的作用,进一步构建其原核表达载体,为探讨趋化因子在HBx感染后的生物学效应奠定基础。【方法】1.HBx转染小鼠肝脏模型的建立:pCMV-tag2B-HBx质粒高压水动力尾静脉注射小鼠,并设立注射pCMV-tag2B空载质粒小鼠作为阴性对照,未经任何处理的小鼠作为空白对照,采用PCR检测HBx基因的表达。2.建立差异基因表达谱:将小鼠肝脏组织送北京博奥生物芯片有限公司进行Microarray检测;挑选感兴趣基因采用实时荧光定量PCR,以及RT-PCR进一步检查趋化因子的表达。3.MIG和IP-10蛋白表达的检测:免疫组化检测肝脏组织中MIG和IP-10的表达,同时ELISA检测肝组织IFN-γ的表达。4.MIG及IP-10原核表达载体的构建、表达与纯化:以pBLAST-mMig:IP10为模板,针对Mig:IP10融合基因区域序列分别设计扩增MIG及IP-10基因,扩增基因克隆至pET42a,重组质粒经测序验证正确及酶切证实载体构建成功后,IPTG诱导表达,PAGE及Western blot鉴定蛋白表达,GST柱纯化表达蛋白。5.趋化实验:以活化的小鼠脾细胞作为靶细胞,采用Transwell法检测表达蛋白对其趋化作用。【结果】1.高压水动力小鼠尾静脉注射HBx,提取小鼠肝细胞RNA,RT-PCR扩增结果表明模型组肝组织中有HBx的表达,表明模型建立成功。2.Microarray筛选出611个表达有差异的基因(ratio>2和ratio<0.5有意义),挑选其中感兴趣的目的基因,采用实时荧光定量PCR建立差异基因表达谱,进一步通过RT-PCR扩增结果表明,4种趋化因子表达上调,分别为Ccl2,Ccl9,MIG及IP-10。3.MIG及IP-10蛋白的表达:免疫组化检测小鼠肝脏中MIG和IP-10的表达,结果表明与基因水平的检查结果一致。4.IFN-γ的表达:ELISA检测结果显示实验组IFN-γ的表达上调,提示小鼠肝细胞转染HBx可诱导IFN-γ与MIG和IP-10的表达上调。5.MIG和IP-10原核表达载体的构建与表达:扩增基因经测序验证正确后克隆至pET42a,经酶切电泳鉴定可见目的条带,表明原核表达载体构建成功。表达载体转化菌经IPTG诱导表达,PAGE及Western blot可见目的蛋白条带,表明原核表达载体转化菌IPTG诱导表达产物经GST纯化后得到纯化的融合蛋白。6.表达蛋白趋化活性:Transwell实验证明表达蛋白对活化的小鼠脾细胞具有趋化作用,表明MIG和IP-10融合蛋白具有生物学活性。【结论】研究结果表明:①HBx在小鼠肝细胞可诱导趋化因子的表达,可诱导MIG和IP-10的高表达,可能参与其免疫炎症过程;②鼠MIG和IP-10原核表达载体构建成功,并获得高效表达,表达产物具有趋化活性,为进一步制备抗体,以及探讨其在HBV感染中的生物学效应奠定了良好的基础。

全文目录

缩略词表  5-7
中文摘要  7-9
Abstract  9-11
前言  11-14
材料  14-18
方法  18-34
结果  34-49
讨论  49-51
小结  51-52
参考文献  52-55
综述  55-67
  参考文献  63-67
致谢  67

HBx转染小鼠细胞因子的表达及GST-MIG，GST-IP-10融合蛋白原核表达载体的构建与表达

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