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原发性胆汁性肝硬化外周血单个核细胞mRNA表达谱的差异分析及差异基因的表达验证

作　者: 李晞
导　师: 李山
学　校: 广西医科大学
专　业: 临床检验诊断学
关键词: 原发性胆汁性肝硬化寡核苷酸阵列分析技术外周血单个核细胞信使核糖核酸免疫球蛋白GFc段受体Ⅲa 酪氨酸激酶结合蛋白穿孔素蛋白
分类号: R575.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

原发性胆汁性肝硬化(Primary biliary cirrhosis,PBC)是一种器官特异性自身免疫性疾病,组织病理学出现肝脏门静脉炎症和肝内胆管免疫介导损伤为主要特点。PBC早期仅有肝功能的异常和自身抗体的产生,晚期发展为肝纤维化和肝硬化。由于近十年来诊断技术和国内外医学界的广泛关注,PBC的确诊率逐年提高。PBC的确切发病机制至今未明,一般认为环境因素作用于具有遗产易感性的个体是PBC的启动因素,同时免疫调节的异常,以及体内各种细胞因子、化学因子水平的变化,均参与PBC的发病。PBC的诊断依赖于血清抗线粒体抗体(Anti-mitochondrial antibodies,AMA)的持续存在,碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)的异常升高和/或肝脏组织病理学的典型改变。而这些标志物并不是PBC特有的标志物。这使PBC的早期诊断,早期治疗遇到了瓶颈。基因芯片技术是近年来发展起来的基因组学研究方式,具有高灵敏度和高通量等特点,现已应用于多种疾病生物标志物的检测及诊断研究。本实验以PBC患者为研究对象,健康人为对照,采用寡核苷酸阵列分析技术(Oligonucleotide Array Sequence Analysis)检测外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)中差异表达的基因。筛选出PBC患者差异表达的基因。差异表达基因以信号通路为单位,采用实时荧光定量PCR(Quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR)技术和流式细胞术(Flow cytometry analysis,FCM)进行表达验证。希望从基因组学方面为PBC的发病机制和探寻生物学标志物提供帮助,为疾病的早期诊断,早期治疗及疗效预后提供参考。目的:比较分析原发性胆汁性肝硬化患者和健康人外周血单个核细胞的mRNA表达谱,为PBC发病机制的研究及生物学标志物的寻找提供帮助。方法:收集PBC患者和健康人各3例,采集外周静脉血,提取外周血单个核细胞总RNA,利用寡核苷酸阵列芯片分析技术(约22000个基因)检测,找出PBC差异表达的基因。结果:外标、内标等阳性对照信号正常,阴性对照检测为阴性;管家基因重复性好,Ratio值CV不超过0.3;无影响数据的污染,漏点率不超过3‰,检测率正常。基因芯片共筛选出356个在PBC中差异表达的基因,其中296个表达上调,60个表达下调。信号通路涉及细胞免疫反应、体液免疫反应、细胞凋亡和物质代谢等过程。结论: PBC患者和健康人PBMCs基因表达水平的不同,为PBC疾病发病机制的探讨和生物学标志物的寻找提供了方向。目的:选取第一部分筛选出的NK细胞介导细胞毒信号通路差异表达基因:FCGR3A,TYROBP和PRF1,扩大样本进行表达验证。方法:利用qRT-PCR技术检测80例PBC患者,55例慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B,CHB)患者和68例健康对照(Healthy control,HC)PBMCs中FCGR3A,TYROBP和PRF1基因mRNA表达量,并用FCM检测FCGR3A和PRF1蛋白在PBMCs各细胞群的表达。结果:PBC患者FCGR3A,TYROBP和PRF1 mRNA表达均高于CHB和HC,和芯片结果一致。FCGR3A蛋白在NK细胞膜上的表达也显著高于CHB和HC,PRF1蛋白在PBMCs各群细胞中的表达率均高于对照组,并和GGT,Tbil及MRS存在相关性。结论: NK细胞介导细胞毒信号通路中差异表达的三个基因经扩大样本验证结果与芯片结果一致。NK细胞介导细胞毒信号通路可能参与PBC的发病与疾病的维持。PRF1可能成为判断PBC患者预后的生物学指标。

全文目录

缩略语对照表  6-8
摘要  8-12
Abstract  12-16
一、原发性胆汁性肝硬化外周血单个核细胞mRNA 表达谱的差异分析  16-41
  1、前言  16-19
  2、材料与方法  19-26
    （1）材料  19-21
    （2）方法  21-26
  3、结果  26-34
  4、讨论  34-36
  5、小结  36-37
  6、参考文献  37-41
二、原发性胆汁性肝硬化外周血单个核细胞mRNA 差异表达的验证  41-66
  1、前言  41-43
  2、材料与方法  43-49
    （1）材料  43-45
    （2）方法  45-49
  3、结果  49-58
  4、讨论  58-61
  5、小结  61-62
  6、参考文献  62-66
三、综述  66-79
  参考文献  75-79
攻读学位期间发表的学术论文  79-80
致谢  80-81

原发性胆汁性肝硬化外周血单个核细胞mRNA表达谱的差异分析及差异基因的表达验证

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