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基于磁性纳米粒子的典型农兽药残留免疫分析技术

作　者: 胡寅
导　师: 沈国清
学　校: 上海交通大学
专　业: 农药学
关键词: 磁性纳米粒子 免疫分析 类特异性 有机磷农药 盐酸克伦特罗
分类号: S859.84
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


长期以来,农兽药残留引起的食品安全问题一直受到国内外的广泛关注,发展可靠、快速、灵敏的残留分析技术已经成为食品安全保障的迫切需求。其中,免疫分析技术是目前农兽药残留快速检测中应用最普遍的技术,也是国内外的研究热点。然而,现有的免疫检测技术在灵敏度、类特异性等方面还无法满足实际检测需求;天然酶免疫标记物的不稳定、容易失活等缺点也限制了相关免疫分析技术的进一步发展。本文以农产品中典型有机磷农药和盐酸克伦特罗(CL)为研究对象,将磁性纳米粒子引入农兽药残留分析技术,在研究制备Fe3O4磁性纳米粒子的基础上,首次研究建立了基于Fe3O4磁性纳米粒子类酶活性的有机磷农药和CL免疫分析技术,为提高农药多残留免疫分析方法的类特异性和灵敏度,促进磁性纳米免疫技术的发展,提升我国农兽药残留监控水平提供了科学依据和技术支持。主要研究结果如下:1.采用共沉淀和氨基修饰法,以1:1000的抗体稀释度为最佳磁珠包被量,制备了功能化Fe3O4纳米磁珠。透射电镜(TEM)扫描及纳米磁珠特性研究结果表明,用3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)修饰的Fe3O4磁性纳米粒子粒径为10nm左右,无明显增厚现象;功能化纳米磁珠的半沉降时间大于1.5 h,抗体包被率最高达57%,表现了良好的稳定性和包被率。2.四甲基联苯胺(TMB)显色反应单因素优化试验结果表明,1 mL底物缓冲液中含有200μL 0.6%(w/v)TMB/DMSO溶液和20μL 75%的H2O2,在20℃、pH4和6min反应条件下,上述Fe3O4磁性纳米粒子的类酶活性最高。3.采用直接竞争法,以CL为研究对象,对常规和基于Fe3O4纳米磁珠类酶活性的酶联免疫检测法(ELISA)进行了研究,结果表明, Fe3O4磁性纳米粒子可代替传统的辣根过氧化物酶(HRP)用于ELISA检测,其最低检测限(LOD)和线性范围接近常规ELISA,分别为0.081和0.177~29.3 ng/mL,交叉反应率、添加回收率均符合检测要求。4.以毒死蜱和喹硫磷为对象,采用间接竞争法(IC-ELISA),研究建立了有机磷农药多残留纳米磁珠ELISA检测方法,并对建立的磁珠一抗(MFA)ELISA进行优化,确定了甲醇溶剂浓度为5%、pH为7.4、制备免疫磁珠时所用抗体稀释度为1:1600的最优检测条件。5.对毒死蜱、喹硫磷等15种农药交叉反应率与回收率研究表明,与传统ELISA相比,纳米磁珠ELISA(mp-ELISA)的灵敏度和类特异性明显增加,其中MFA-ELISA对14种有机磷农药的平均交叉反应率为34%,比传统ELISA提高了127%,而对呋喃丹等氨基甲酸酯类农药无特异性反应;MFA-ELISA对毒死蜱的回收率为78-107%,喹硫磷77-110%,符合农残检测要求。6.采用间接竞争法,对研究建立的CL单残留传统ELISA和纳米免疫磁珠ELISA检测方法进行比较,结果表明,MFA-ELISA具有灵敏度高,特异性强的特点,与传统ELISA相比,抑制中浓度(IC50)降低了28%。猪肉样品中添加回收率研究结果表明,传统ELISA和纳米免疫磁珠ELISA的回收率分别为82.3%~115.1%和83.1%~105.6。7.以磁性Fe3O4纳米粒子为材料,毒死蜱和CL为检测对象,通过优化试验反应条件,研究建立了基于Fe3O4磁性纳米粒子的半定量胶体金免疫层析试纸条。结果表明,在优化条件下,该方法的检测灵敏度与传统的胶体金免疫层析试纸条相似,具有成本低、制作简单、使用方便、能半定量检测等优点。

全文目录


摘要  5-8
ABSTRACT  8-11
术语和缩略语表  11-16
第一章 绪论  16-28
  1.1 免疫分析技术简介  16-18
    1.1.1 酶联免疫吸附法  17
    1.1.2 胶体金免疫层析法  17-18
  1.2 纳米粒子在免疫分析中的应用  18-21
    1.2.1 在ELISA 中的应用  18-19
    1.2.2 在胶体金免疫标记技术中的应用  19-20
    1.2.3 在生物传感器中的应用  20-21
  1.3 磁性纳米粒子的制备与功能化  21-25
    1.3.1 磁性纳米粒子及其特性  21-22
    1.3.2 磁性纳米粒子的制备  22-23
    1.3.3 磁性纳米粒子的表面修饰  23-24
    1.3.4 磁性纳米粒子的功能化  24-25
  1.4 研究目的和意义  25-26
  1.5 研究内容  26-27
  1.6 技术路线  27-28
第二章 Fe_30_4磁性纳米粒子的制备与功能化  28-34
  2.1 材料与方法  28-30
    2.1.1 试剂  28-29
    2.1.2 仪器  29
    2.1.3 Fe_30_4 磁性纳米粒子制备与氨基化修饰  29-30
    2.1.5 功能化Fe_30_4 免疫磁珠的制备  30
    2.1.6 功能化Fe_30_4 免疫磁珠稳定性与抗体包被率测定  30
  2.2 结果与分析  30-33
    2.2.1 Fe_30_4 纳米磁珠的TEM 分析  30-31
    2.2.2 抗体用量对Fe_30_4 免疫磁珠稳定性的影响  31-32
    2.2.3 抗体用量对免疫磁珠包被率的影响  32-33
  2.3 小结  33-34
第三章 磁性纳米粒子的类酶活性及其在ELISA 中的应用  34-50
  3.1 材料与方法  34-39
    3.1.1 试剂  34-35
    3.1.2 仪器  35
    3.1.3 磁性Fe_30_4 纳米颗粒的制备  35
    3.1.4 不同条件下磁性 Fe_30_4 纳米颗粒类酶活性的测定  35
    3.1.5 酶标半抗原的制备  35-37
    3.1.6 磁性纳米粒子抗原复合物的合成  37
    3.1.7 基于磁性纳米粒子的ELISA 分析方法  37-39
  3.2 结果与分析  39-49
    3.2.1 Fe_30_4 磁性纳米粒子的类酶催化活性  39-40
    3.2.2 TMB 用量对Fe_30_4 磁性纳米粒子催化酶学反应的影响  40-41
    3.2.3 H202 用量对Fe_30_4 磁性纳米粒子催化酶学反应的影响  41
    3.2.4 反应条件对Fe_30_4 磁性纳米粒子催化酶学反应的影响  41-44
    3.2.5 Fe_30_4 磁性纳米粒子类酶活性在ELISA 中的应用  44-49
  3.3 小结  49-50
第四章 基于磁性纳米粒子的有机磷农药多残留ELISA 方法  50-64
  4.1 材料与方法  50-55
    4.1.1 试剂  50-51
    4.1.2 仪器  51-52
    4.1.3 纳米磁珠间接竞争ELISA 方法的建立  52
    4.1.4 有机磷通用包被原的合成  52-53
    4.1.5 对有机磷农药毒死蜱和喹硫磷的检测  53-54
    4.1.6 MFA-ELISA 方法条件的优化  54
    4.1.7 蔬菜样品中毒死蜱和喹硫磷的添加回收率  54-55
  4.2 结果与分析  55-63
    4.2.1 有机磷农药毒死蜱和喹硫磷的竞争抑制曲线  55-57
    4.2.2 MFA-ELISA 检测条件优化  57-59
    4.2.3 有机磷农药毒死蜱的抑制标准曲线  59-60
    4.2.4 交叉反应率  60-62
    4.2.5 添加回收率  62
    4.2.6 变异系数  62-63
  4.3 小结  63-64
第五章 基于磁性纳米粒子的盐酸克伦特罗ELISA 检测方法  64-72
  5.1 材料与仪器  64-67
    5.1.1 试剂  64-65
    5.1.2 仪器  65
    5.1.3 纳米磁珠间接竞争ELISA 方法的建立  65
    5.1.4 包被原的合成  65-66
    5.1.5 包被原和抗体工作浓度确定  66
    5.1.6 标准曲线的建立  66-67
    5.1.7 添加回收率试验  67
  5.2 结果与分析  67-71
    5.2.1 包被原与抗体工作浓度的确定  67-68
    5.2.2 CL 检测竞争抑制曲线  68-69
    5.2.3 交叉反应  69-70
    5.2.4 添加回收率  70-71
    5.2.5 变异系数  71
  5.3 小结  71-72
第六章 磁性纳米粒子在胶体金试纸条中的应用  72-85
  6.1 材料和仪器  72-73
    6.1.1 材料  72
    6.1.2 仪器  72-73
  6.2 胶体金简易免疫试纸条的制备  73-74
    6.2.1 胶体金溶液的制备  73
    6.2.2 金标抗体的制备  73-74
  6.3 免疫胶体金试纸条的制备  74-76
    6.3.1 包被原吸附于硝酸纤维素膜  74
    6.3.2 硝酸纤维素膜的封闭  74-75
    6.3.3 金标抗体与NC 膜反应  75
    6.3.4 免疫金试纸条的组装及使用  75-76
  6.4 结果与分析  76-84
    6.4.1 胶体金的制备及鉴定  76-79
    6.4.2 免疫胶体金试纸条的制备  79-84
  6.5 小结  84-85
第七章 结论与展望  85-88
  7.1 结论  85-87
  7.2 创新点  87
  7.3 展望  87-88
参考文献  88-92
致谢  92-93
攻读硕士学位期间发表的论文  93-95

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医药物学 > 兽医毒物学 > 动物性食品中化学物残留
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