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山羊痘病毒（GTPV）高效表达载体的构建及其鉴定

作　者: 张娜
导　师: 陈创夫
学　校: 石河子大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 山羊痘病毒(GTPV) 双向启动子 报告基因 Pb56(-) Pb56(+) 转录活性
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


目的：山羊痘病毒(GTPV)为痘病毒科,羊痘病毒属的一个成员,基因组呈线性,全K约150 kb,编码147个开放阅读框,是牛、羊等重大传染病重组活疫苗的理想载体。由于插入的外源基因表达量低--启动子转录活性低,本研究旨于构建一个能够高效表达外源基因的山羊痘病毒(GTPV)表达载体。方法：预测GTPV基因组中早期转录因子VETF-1和中期转录因子VITF-3基因序列之间56 bp的一段序列为一双向启动子,两个方向分别命名为Pb56(-),Pb56(+)。通过PCR技术将该启动子的两个方向分别与绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因融合,构建转移载体,分别命名为pUC-TK12-Pb56(+)-EGFP,pUC-TK12-Pb56(-)-EGFP。用脂质体转染法将2个转移载体以及阴性对照转移载体pUC-TK12-EGFP,标准载体pUC-TK12-P7.5-EGFP分别与GTPV共转染至BHK细胞；采用EGFP报告基因系统通过荧光共聚焦显微镜,流式细胞仪,荧光实时定量PCR等技术鉴定双向启动子并对其活性进行了定量的测定。将布鲁氏菌的外膜蛋白蛋白基因omp25作为外源基因插入到验证好的双向启动子后,构建载体命名为pUC 119-TK-Pb56(-)-omp25,通过Western-blotting对外源基因的表达活性进行验证。结果：该基因序列的两个方向均能启动EGFP的表达,初步证实了该基因序列为一GTPV的双向启动子：Pb56(-),Pb56(+)的转录活性均高于痘苗病毒(VV)的P7.5启动子；外源基因omp25得到了成功表达并且具有免疫原性。结论：筛选出转录活性高于痘苗P7.5启动子的山羊痘病毒自身的双向启动子,为解决外源基因表达量低提供了理论基础。

全文目录


摘要  6-7
Abstract  7-8
目录  8-10
英文缩略表  10-11
第一章 文献综述羊痘病毒分子生物学研究进展  11-18
  1 羊痘病毒的分子生物学特征  11-12
    1.1 羊痘病毒的形态结构特征  11
    1.2 羊痘病毒的基因组结构特征  11-12
    1.3 羊痘病毒的复制特点  12
  2 羊痘病毒载体  12-14
    2.1 羊痘病毒作为载体的优点  12-13
    2.2 羊痘病毒载体的构建  13-14
    2.3 羊痘病毒载体的应用  14
  3 启动子克隆方法及功能分析研究进展  14-16
    3.1 启动子序列克隆的方法及其适用性  15
    3.2 启动子功能分析的方法及其策略  15-16
  4 报告基因的研究进展  16-18
    4.1 荧光素酶(luciferase,luc)  16-17
    4.2 绿色荧光蛋白(green flourscent protein, GFP)  17-18
第二章 以绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因,融合山羊痘病毒(GTPV)自身启动子的重组载体的构建  18-40
  1 材料与方法  18-33
    1.1 实验材料  18-19
    1.2 Vero细胞的培养及山羊痘病毒的增殖  19-20
    1.3 目的基因TK,Pb56(-)-EGFP,Pb56(+)-EGFP,7.5-EGFP,EGFP的扩增  20-26
    1.4 转移载体的构建  26-33
  2 结果  33-38
    2.1 vero细胞的培养  33
    2.2 山羊痘病毒(GTPV)的增殖  33-35
    2.3 目的基因TK,Pb56(-)-EGFP,Pb56(+)EGFP,7.5-EGFP,EGFP的扩增  35-36
    2.4 转移载体的构建  36-38
  3 讨论  38-40
第三章 山羊痘病毒自身双向启动子的鉴定及其表达  40-57
  1 材料和方法  41-51
    1.1 实验材料  41
    1.2 BHK-21细胞的培养  41-42
    1.3 激光共聚焦显微镜观察绿色荧光蛋白的表达  42-43
    1.4 流式细胞仪检测EGFP在BHK-21细胞中的表达量  43
    1.5 实时定量PCR技术检测双向启动子不同方向的转录活性  43-51
  2 结果  51-55
    2.1 激光共聚焦电子显微镜验证绿色荧光蛋白的表达  51-52
    2.2 流式细胞仪对蛋白表达量的定量检测  52-53
    2.3 实时定量PCR技术检测mRNA水平绿色荧光蛋白的表达  53-55
  3 讨论  55-57
第四章 表达布鲁氏菌omp25基因重组载体的构建及其表达  57-65
  1 材料和方法  57-62
    1.1 实验材料  57-58
    1.2 目的基因omp25的扩增  58-59
    1.3 PMD18-Pb56(-)-omp25载体的构建  59-60
    1.4 pUC119-TK12-Pb56(-)-omp25载体的构建  60-61
    1.5 转移载体pUC119-TK12-Pb56(-)-omp25与GTPV共转染BHK-21细胞  61
    1.6 Western-blotting检验目的基因omp25的表达  61-62
  2 结果  62-63
    2.1 目的基因Pb56(-)-omp25的扩增  62
    2.2 转移载体pUC119-TK12-Pb56(-)-omp25的构建  62-63
    2.3 SDS-PAGE凝胶电泳及Western-blotting检测目的基因omp25的表达  63
  3 讨论  63-65
参考文献  65-69
致谢  69-70
个人简介  70-71
导师评阅表  71

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
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