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水通道蛋白4敲除取消帕金森病模型中多巴胺能神经元差异性损伤

作　者: 梁睿
导　师: 胡刚
学　校: 南京医科大学
专　业: 药理学
关键词: 水通道4 帕金森病黑质致密部腹侧被盖区星形胶质细胞小胶质细胞
分类号: R742.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）又称"震颤麻痹"，是常见的中枢神经系统慢性退行性疾病。易发于中老年人，主要表现为动作缓慢、静止性震颤、肌肉僵直及平衡失调等临床症状。此疾病典型的病理特征是黑质致密部（substantia nigra compact，SNc）多巴胺（dopamine，DA）能神经元变性、坏死，Lewy’s小体出现及纹状体DA含量降低，目前机制尚不清楚。在PD患者和动物模型中，DA能神经元损伤具有差异性，表现为中脑黑质（substantia nigra，SN）DA能神经元的胞体及其轴突末梢损伤严重,而其邻近部位中脑腹侧被盖区（ventral tegmental area，VTA）的DA能神经元的胞体及其轴突末梢受累较轻。至今，这种差异性损伤的机制仍不清楚，有研究表明SN区与能量代谢相关的基因高表达，而在VTA区与神经营养功能相关的基因高表达。传统上认为，中枢神经系统（central nervous system，CNS）的胶质细胞，包括星形胶质细胞和小胶质细胞，对神经元起着重要的营养、支持作用。星形胶质细胞是数目上占绝对优势的一类大胶质细胞，除了对神经元起支持、营养、缓冲离子浓度及协助代谢等作用外，还能释放各种“胶质递质”，如谷氨酸、ATP和D-丝氨酸，主动参与神经元介导的各种生理病理功能。此外有研究报道不同脑区星形胶质细胞存在膜受体分布、胞质活性物质及对创伤反应的异质性。小胶质细胞是脑内固有的免疫细胞，正常情况下对神经元有营养作用，但过度活化会介导脑内的炎症反应。愈来愈多的证据表明星形胶质细胞与小胶质细胞在PD的发生发展中起重要作用。临床和动物模型的研究结果均发现DA能神经元损伤过程伴有明显的星形胶质细胞活化和增殖。星形胶质细胞中的单胺氧化酶B(monoamine oxidase B，MAO-B)和突触核蛋白（synuclein）与神经元变性相关。此外，过度活化的星形胶质细胞能产生和释放大量有害因子，如活性氧族（reactive oxygen species，ROS），活性氮族（reactive nitrogen species，RNS）及促炎因子等，加重DA能神经元损伤。大量研究表明PD病理过程小胶质细胞过度活化，其介导的炎症反应是DA能神经元慢性进行性死亡的主要驱动力，抑制小胶质细胞活化可以发挥保护DA能神经元的作用。小胶质细胞的活化受到星形胶质细胞调节，已有实验证明星形胶质细胞释放的ATP可以诱导小胶质细胞活化及白介素-1β（interleukin-1 beta，IL-1β）释放。调节星形胶质细胞和小胶质细胞功能对于延缓PD的病理进展具有重要作用。水通道蛋白4（aquaporin-4，AQP4）是脑内表达最丰富的水通道亚型，主要表达在星形胶质细胞上，也有研究报道活化的小胶质细胞表达AQP4。本实验室的前期研究发现：AQP4敲除增加DA能神经元对致PD神经毒素1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrapyridine，MPTP）的敏感性，机制与AQP4调节星形胶质功能相关。AQP4在星形胶质细胞功能调节中发挥重要作用，如AQP4敲除减少星形胶质细胞向损伤部位的迁移，下调星形胶质细胞谷氨酸摄取和谷氨酸转运体的表达。那么AQP4敲除后，SN区与VTA区DA能神经元损伤是否还存在差异，AQP4又如何通过调节胶质细胞功能影响DA神经元对MPTP的敏感性，目前尚不清楚。因此，在前期研究基础上，本文工作应用MPTP建立亚急性损伤模型，研究AQP4敲除对SN区和VTA区胶质细胞增殖活化及DA能神经元损伤的影响，并在离体水平深入研究AQP4对星形胶质细胞及小胶质细胞功能的调节作用。目的：在整体、细胞及水平研究AQP4敲除对PD模型中SN区和VTA区DA能神经元损伤的影响，并探讨相关机制。方法：1）16～18周龄雄性野生型（AQP4+/+）和AQP4敲除（AQP4-/-）CD1小鼠随机分为生理盐水组、MPTP造模组，共4组，每组16只。应用MPTP腹腔注射（一天四次，每次20 mg/kg，间隔2 h，总量为80 mg/kg)制备PD小鼠模型；2）应用免疫组织化学法观察DA能神经元损伤、星形胶质细胞及小胶质细胞增殖、活化；3)应用Western Blotting法和细胞免疫荧光法观察AQP4敲除对MPP+诱导中脑星形胶质细胞iNOS表达的影响；4）利用中脑星形胶质细胞与小胶质细胞共培养技术研究AQP4敲除对MPP+所致小胶质细胞活化的影响；5）化学发光法观察AQP4敲除对中脑星形胶质细胞ATP释放的影响。结果：1）在给予生理盐水的对照组中，AQP4-/-小鼠SN区及VTA区DA能神经元与AQP4+/+小鼠相比数量上没有显著性差异。给予MPTP的AQP4+/+小鼠SN区DA能神经元显著减少，纹状体DA含量显著降低，但VTA区DA能神经元数目与对照组相比没有显著差异；给予MPTP的AQP4-/-小鼠SN区DA能神经元数目及纹状体DA含量减少更显著，VTA区DA能神经元数目也显著减少，表明SN区与VTA区DA能神经元差异性损伤被取消。2）给予生理盐水的AQP4+/+小鼠仅在黑质网状部（substantial nigra pars reticulate，SNr）出现少量的星形胶质细胞，而AQP4-/-小鼠不仅SNr区有大量的星形胶质细胞，并且SNc区和VTA区也出现星形胶质细胞。给予MPTP后，AQP4+/+小鼠SNr区与SNc区星形胶质细胞显著增殖；AQP4-/-小鼠SNc区与VTA区星形胶质细胞显著增殖，SNr区星形胶质细胞增殖较对照组没有显著增强，各脑区增殖水平均高于AQP4+/+小鼠；3）给予生理盐水的AQP4-/-小鼠中脑出现小胶质细胞增殖活化；给予MPTP后，AQP4+/+小鼠中脑小胶质细胞显著增殖活化，而AQP4-/-小鼠小胶质细胞增殖活化更显著；此外，在体和离体实验均发现静息及活化状态小胶质细胞均不表达AQP4。4）离体研究表明，未给药组的AQP4+/+及AQP4-/-中脑星形胶质细胞iNOS表达量均较低；给予MPP+（10μM）后，两种基因型星形胶质细胞均活化，且iNOS表达增加，而在AQP4-/-星形胶质细胞活化及iNOS表达增加更显著。5）中脑星形胶质细胞与小胶质细胞共培养研究表明：MPP+（10μM）不能直接诱导单独培养的AQP4+/+、AQP4-/-小胶质细胞活化，但能引起与星形胶质细胞共培养的两种基因型小胶质细胞活化；且与AQP4-/-星形胶质细胞共培养时MPP+诱导的两种基因型小胶质细胞活化率更高。6）基础状态下，AQP4+/+及AQP4-/-星形胶质细胞ATP释放水平没有显著差异，MPP+增加两种基因型星形胶质细胞ATP释放，并且使AQP4-/-星形胶质细胞ATP释放增加更显著。结论：AQP4敲除加重PD病理模型中DA能神经元损伤，并取消SN区和VTA区DA能神经元损伤差异，其机制与诱导星形胶质细胞过度增殖活化、iNOS过度表达、ATP释放增加促进小胶质细胞活化相关，提示SN区和VTA区星形胶质细胞的增殖活化状态不同是造成DA能神经元差异性损伤的机制之一。本文工作的主要创新之处在于：1）揭示星形胶质细胞增殖活化的差异是造成PD模型中SN区和VTA区DA能神经元差异性损伤的因素之一，为进一步探讨PD中SN区DA能神经元的损伤机制提供新思路。2）揭示AQP4调节星形胶质细胞ATP释放，从而参与小胶质细胞活化介导的神经炎性反应，深化了对脑内AQP4作用的认识。

全文目录

英文缩略词表  5-7
中文摘要  7-11
英文摘要  11-16
前言  16-24
材料与方法  24-28
结果  28-37
讨论  37-40
结论  40-41
参考文献  41-48
附录  48-49
综述  49-63
  参考文献  57-63
致谢  63

水通道蛋白4敲除取消帕金森病模型中多巴胺能神经元差异性损伤

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