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胆碱乙酰转移酶在人牙周膜细胞中的表达及尼古丁对其表达的影响

作　者: 葛鑫
导　师: 王小竞
学　校: 第四军医大学
专　业: 口腔临床医学
关键词: 尼古丁 人牙周膜成纤维细胞 胆碱乙酰转移酶 RT-PCR 免疫荧光
分类号: R781.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


吸烟损伤牙周组织,是慢性牙周炎的主要危险因素。吸烟人群牙周炎的发病率远远高于非吸烟人群,并且在牙周炎患者中,吸烟人群的牙周组织破坏更加明显。尼古丁作为烟草中的主要生物碱,除可直接损伤牙周组织,还可通过妨碍牙周组织免疫系统正常功能加速其损坏,但确切作用机制尚未明了。研究发现,胆碱乙酰转移酶(choline acetyltransferase,ChAT)在尼古丁对机体组织损伤过程中发挥重要作用。为观察胆碱乙酰转移酶(choline acetyltransferase , ChAT)在人牙周膜成纤维细胞(Periodontal ligament fibroblast,PDLF)中的表达,并探讨ChAT调节在参与尼古丁对PDLF损伤过程中的作用,本研究通过建立尼古丁作用下PDLF体外实验模型,采用RT-PCR,DNA测序和免疫组化等方法,观察PDLF中是否存在ChAT及在尼古丁作用下其表达的改变。旨在探讨ChAT在尼古丁与吸烟相关性牙周炎发生发展中的作用,为寻找新的牙周炎防治途径提供理论和实验依据。1人牙周膜成纤维细胞中ChAT的表达取12-18岁志愿者正畸减数拔除的健康第一前磨牙,刮取根中1/3处牙周膜组织,改良组织块法原代培养PDLF,鉴定,传代,4-6代细胞用于实验。采用免疫荧光及RT-PCR方法检测PDLF中ChAT的表达。免疫荧光结果显示,PDLF胞浆中存在ChAT的阳性表达;RT-PCR结果显示在与阳性对照组相同位置299 bp处可见阳性条带,且经克隆测序证实扩增产物为ChAT。初步证实,在PDLF中存在ChAT蛋白及mRNA表达。2尼古丁对ChAT在人牙周膜成纤维细胞中表达的影响第4代PDLF随机分为两组,对照组:5%新生牛血清DMEM培养液;实验组:尼古丁硫酸盐(10-12mol/L)溶于含5%新生牛血清DMEM培养液。37℃、5% CO2孵箱中孵育24h。RT-PCR、实时定量PCR及免疫荧光方法检测尼古丁对ChAT在PDLF表达的影响。免疫荧光结果显示,正常及尼古丁作用下PDLF存在ChAT阳性表达,表达主要位于胞浆。与对照组相比,尼古丁作用24h后,实验组PDLF ChAT阳性信号增强。RT-PCR结果表明,与对照组相比,尼古丁作用24h后PDLF PCR扩增产物ChAT mRNA阳性表达增强;经quantity one分析,表达水平差异有统计学意义(P﹤0.05),实时定量PCR进一步证实该结果。以上结果证实,PDLF中存在ChAT蛋白、mRNA表达;尼古丁可明显上调其表达。由此推测ChAT可能为尼古丁在牙周组织的作用靶点,在吸烟相关性牙周炎的发生发展中发挥了重要作用。

全文目录


缩略语表  6-7
中文摘要  7-9
英文摘要  9-12
前言  12-14
文献回顾  14-26
正文  26-47
  实验一 人牙周膜成纤维细胞中ChAT 的表达  26-38
    1 细胞培养及鉴定  26-29
      1.1 主要仪器和试剂  26
      1.2 细胞培养方法和步骤  26-27
      1.3 细胞鉴定  27
      1.4 结果  27-29
    2 人牙周膜成纤维细胞中ChAT m RNA 的表达  29-33
      2.1 主要仪器和试剂  29
      2.2 方法  29-30
      2.3 结果  30-33
    3 人牙周膜成纤维细胞中ChAT 蛋白的表达  33-35
      3.1 主要仪器和试剂  33
      3.2 方法  33
      3.3 结果  33-35
    4 讨论  35-38
  实验二 尼古丁对ChAT 在人牙周膜成纤维细胞中表达的影响  38-47
    1 尼古丁对ChAT 在人牙周膜成纤维细胞中mRNA 表达的影响  38-41
      1.1 主要仪器和试剂  38
      1.2 方法及步骤  38-39
      1.3 统计学处理  39-40
      1.4 结果  40-41
    2 尼古丁对ChAT 在人牙周膜成纤维细胞中蛋白表达的影响  41-44
      2.1 主要仪器和试剂  41
      2.2 方法及步骤  41-42
      2.3 统计学处理  42
      2.4 结果  42-44
    3 讨论  44-47
小结  47-48
参考文献  48-58
个人简历和研究成果  58-59
致谢  59

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中图分类: > 医药、卫生 > 口腔科学 > 口腔内科学 > 牙周病
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