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O型FMDV VP1基因与山羊IL-18基因在昆虫细胞中的共表达与活性检测

作　者: 王婷婷
导　师: 赵宏坤
学　校: 山东农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: FMDV VP1基因山羊白细胞介素18 昆虫杆状病毒表达系统共表达生物学活性
分类号: S852.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

口蹄疫(Foot and Mouth Disease, FMD)是危害牛、猪、羊等偶蹄动物以及人的一种烈性传染病,被国际兽疫局(OIE)列为A类疾病。目前预防FMD的最有效措施是接种疫苗,结构蛋白VP1是FMDV最主要的抗原,能够刺激机体产生抗FMDV的中和抗体,在口蹄疫免疫预防的研究中倍受关注,对口蹄疫基因工程疫苗的研制具有重要的意义。白细胞介素18(Interleukin-18, IL-18)具有多种生物学活性,在免疫调节、抗感染及慢性炎症性疾病发病过程中起着重要作用。因此,IL-18可作为免疫佐剂与一些病原微生物的保护性基因共表达,从而加强和改善疫苗的免疫效果。鉴于此,本实验室对山羊白介素18(goat interleukin-18, gIL-18)成熟蛋白基因与VP1基因在昆虫杆状病毒系统中进行了共表达,旨在探索gIL-18对口蹄疫的免疫调节作用,为研制有效的口蹄疫疫苗奠定了基础。根据GenBank上已发表的序列,设计两对引物,分别以pMD18-T-VP1和pET32a-gIL18质粒为模板,扩增山羊白细胞介素18成熟蛋白cDNA基因序列及O型口蹄疫病毒VP1基因序列。再以杆状病毒pFastBac~TM Dual为载体,将VP1基因和gIL-18基因分别插入到双表达载体的P10启动子和多角体蛋白启动子PH的下游,构建重组转移载体质粒pFastBac~TM Dual-gIL18-VP1。然后转化DH10Bac感受态细胞,经三重抗性(含卡那霉素、庆大霉素和四环素)与蓝白斑筛选,用小量法提取杆状病毒重组质粒DNA,在此基础上通过一对通用引物M13(该引物扩增重组质粒Bacmid LacZα区域内的mini-attTn7位点两端的片段,任何外源性基因片段插入pFastBac~TM dual质粒内都会使PCR产物增大)进行PCR扩增,鉴定pFastBac~TM dual- gIL18-VP1质粒克隆到杆状病毒表达载体,获得杆状病毒重组质粒Bacmid-gIL18-VP1。在转染试剂Cellfectin的作用下,将Bacmid-gIL18-VP1转染至草地贪夜蛾细胞(Spodoptera frugiperda 9, sf9)获得重组杆状病毒,然后将重组杆状病毒感染sf9,感染后不同时间收获sf9细胞及培养上清,进行SDS-PAGE电泳、Western blot和间接免疫荧光试验(IFA)检测,分析表达情况并对共表达产物进行生物学活性分析。结果表明,用昆虫杆状病毒表达系统成功构建了同时含有gIL-18成熟蛋白基因和O型口蹄疫病毒VP1基因的重组杆状病毒,两者均在昆虫细胞的裂解上清中得到了高效表达,表达的蛋白是可溶性的且具有良好的免疫原性,表达的目的条带分子量分别约为18.3KD和23.5KD。IFA检测显示gIL-18基因和VP1基因同时在同一细胞中独立表达;生物学活性分析表明,适宜浓度的共表达产物能够刺激淋巴细胞增殖、诱导山羊脾淋巴细胞生成IFN-γ抑制水疱性口炎病毒(VSV)在牛肾细胞(MDBK)上生长。从而为下一步研究gIL-18在口蹄疫中的免疫调节作用奠定了坚实的基础。

全文目录

符号说明  8-10
中文摘要  10-12
英文摘要  12-14
1 引言  14-40
  1.1 口蹄疫研究进展  14-23
    1.1.1 口蹄疫概述  14
    1.1.2 口蹄疫病毒的血清学  14-15
    1.1.3 口蹄疫的流行概况  15
    1.1.4 口蹄疫病毒的结构和功能  15-16
    1.1.5 口蹄疫病毒结构蛋白VP1 的病原特征  16-17
    1.1.6 O 型口蹄疫病毒抗原位点  17
    1.1.7 口蹄疫病毒VP1 的抗原位点  17-18
    1.1.8 口蹄疫病毒VP1 免疫机制  18-19
    1.1.9 口蹄疫病毒VP1 新型疫苗的研究进展  19-23
  1.2 IL-18 的研究发展  23-31
    1.2.1 IL-18 的发现  23
    1.2.2 IL-18 的分布与产生  23-25
    1.2.3 IL-18 的基因结构和基因表达调控  25
    1.2.4 IL-18 的的合成与表达  25-26
    1.2.5 IL-18 的生物学作用  26-28
    1.2.6 山羊IL-18 的研究进展  28-29
    1.2.7 IL-18 的免疫增强作用  29
    1.2.8 IL-18 的应用前景  29-31
  1.3 杆状病毒表达系统研究进展  31-39
    1.3.1 杆状病毒的分子生物学  31-34
    1.3.2 重组杆状病毒的构建  34-37
    1.3.3 杆状病毒表达载体系统的优越性  37-38
    1.3.4 杆状病毒表达载体系统在口蹄疫和反刍动物IL-18 中的应用  38-39
  1.4 研究的目的及意义  39-40
2 材料与方法  40-59
  2.1 材料  40-47
    2.1.1 菌株、质粒及细胞  40-42
    2.1.2 主要试剂  42-43
    2.1.3 培养基及主要试剂的配制方法  43-46
    2.1.4 主要仪器及设备  46-47
  2.2 方法  47-59
    2.2.1 引物设计及合成  47-48
    2.2.2 gIL-18 基因重组转移载体的构建  48-53
      2.2.2.1 gIL-18 基因的克隆  48-49
      2.2.2.2 gIL-18 基因的PCR 产物的回收纯化  49-50
      2.2.2.3 gIL-18 基因片段和pFastBac~TM Dual 的酶切  50
      2.2.2.4 gIL-18 基因片段和pFastBac~TM Dual 的连接  50
      2.2.2.5 连接产物转化DH5α感受态细胞  50-51
      2.2.2.6 gIL-18 基因重组质粒的鉴定  51-53
    2.2.3 VP1 基因重组转移载体的构建  53
    2.2.4 gIL-18 和VP1 基因共表达重组转移载体的构建  53-54
    2.2.5 重组质粒的转座  54-55
    2.2.6 重组Bacmid DNA 的提取及鉴定  55-56
    2.2.7 重组Bacmid 转染sf9 昆虫细胞及收获重组杆状病毒  56-57
      2.2.7.1 重组Bacmid 转染sf9 昆虫细胞  56-57
      2.2.7.2 收获重组杆状病毒  57
      2.2.7.3 扩增重组杆状病毒液  57
    2.2.8 gIL-18 和VP1 在sf9 昆虫细胞中的表达与鉴定  57-58
      2.2.8.1 Western blot 鉴定  58
      2.2.8.2 IFA 鉴定  58
    2.2.9 共表达产物的生物学活性检测  58-59
      2.2.9.1 体外刺激山羊脾淋巴细胞的增殖  58-59
      2.2.9.2 共表达产物诱导IFN-γ生成及抑制VSV 病毒的活性  59
3 结果与分析  59-70
  3.1 gIL-18 和VP1 基因扩增  59-60
  3.2 重组转移载体的构建与鉴定  60-61
    3.2.1 gIL-18 基因重组杆状病毒转移载体的构建  60
    3.2.2 VP1 基因重组杆状病毒转移载体的构建  60
    3.2.3 gIL-18 和VP1 基因共表达重组杆状病毒转移载体的构建  60-61
  3.3 重组Bacmid 的筛选与鉴定  61-63
  3.4 gIL-18 和VP1 在sf9 昆虫细胞中的表达  63-67
    3.4.1 重组杆状病毒的细胞病变观察  63-64
    3.4.2 表达产物的SDS-PAGE 和Western blot 分析  64-67
  3.5 gIL-18 和VP1 在sf9 昆虫细胞中的共表达  67
  3.6 共表达产物的生物学活性检测  67-70
    3.6.1 体外刺激山羊脾淋巴细胞的增殖  67-68
    3.6.2 诱导淋巴细胞分泌IFN-γ和抑制VSV 病毒活性测定  68-70
4 讨论  70-73
5 结论  73-74
参考文献  74-84
致谢  84-85
攻读学位期间发表论文情况  85

O型FMDV VP1基因与山羊IL-18基因在昆虫细胞中的共表达与活性检测

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