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PRRSV感染激活RANTES产生的信号通路研究

作　者: 王艳伟
导　师: 肖少波
学　校: 华中农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪繁殖与呼吸综合征病毒 RANTES 核因子κB MAPK Toll样受体
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起,临床上表现严重的间质性肺炎,提示炎症因子在PRRSV的致病中扮演着十分重要的角色,但其作用的分子细节尚不十分清楚。趋化因子RANTES是一种重要的炎症因子,能高效趋化T淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性细胞、嗜碱性细胞,调节白细胞移行到感染部位,从而参与激活免疫反应。但RANTES与PRRSV感染之间的关系尚不清楚,鉴于此,本课题开展了PRRSV感染细胞后RANTES的表达以及PRRSV调控RANTES表达信号通路的研究。具体内容如下：1.PRRSV感染Marc-145细胞激活RANTES利用荧光定量RT-PCR和RANTES启动子荧光素酶报告系统,于感染后不同时间检测RANTES的表达,发现PRRSV感染Marc-145细胞显著上调RANTES基因的转录,且呈感染时间和感染剂量依赖性。进一步的研究发现,紫外灭活的PRRSV不能激活RANTES,提示PRRSV激活RANTES与PRRSV的增殖密切相关。2.PRRSV感染Marc-145细胞激活RANTES与NF-κB密切相关利用RANTES启动子各转录因子结合位点缺失突变体的荧光素酶报告系统,发现核因子κB (NF-κB)在PRRSV感染激活RANTES中起最关键的调节作用,干扰素刺激反应元件ISRE不参与RANTES基因的转录,而CRE和NF-IL6位点对PRRSV激活RANTES的作用不显著。为了证实转录因子NF-κB在PRRSV感染激活RANTES中的关键作用,进一步利用NF-κB抑制剂BAY11-7082处理细胞或以IkB的负调控突变体(mIκBα)表达质粒转染细胞,结果均能显著抑制PRRSV诱导的RANTES基因转录,说明NF-κB信号通路确实参与PRRSV诱导RANTES.3.PRRSV感染Marc-145细胞激活RANTES的上游信号通路分析为了揭示PRRSV感染激活RANTES产生的上游信号通路,以MAPK通路的反式激活质粒pFA2-ELK1转染细胞,证实PRRSV感染Marc-145细胞能激活MAPK通路。进一步采用ERK1/2、p38和JNK这3条MAPK通路的抑制剂分别处理细胞,结果发现ERK1/2抑制剂U0126呈浓度依赖性下调RANTES基因的转录,转染ERK负调控突变体也得到了相同的结果,表明ERK1/2通路参与了PRRSV诱导RANTES的产生。同时,对NF-κB的两条上游信号通路TLRs、RIG-Ⅰ的主要接头蛋白(MyD88、TRIF、TRAF6、RIG-Ⅰ、TRAF2)在PRRSV感染激活RANTES中的作用进行分析,发现TLR信号通路中接头分子MyD88、TRIF、TRAF6参与了PRRSV感染激活RANTES,而与RIG-Ⅰ和TRAF2无关,说明PRRSV感染主要通过TLR通路诱导RANTES的产生,但RIG-Ⅰ通路的作用不大。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-9
缩略语表(Abbreviation)  9-11
第1章文献综述  11-21
  1.1 猪繁殖与呼吸综合征  11
  1.2 PRRSV病原特征  11
  1.3 PRRSV的免疫学反应  11-12
  1.4 趋化因子(chemokines)  12-14
    1.4.1 趋化因子的分类  13
    1.4.2 趋化因子的生物学活性  13
    1.4.3 趋化因子与疾病  13-14
  1.5 激活RANTES产生的相关信号通路  14-19
    1.5.1 NF-κB信号转导途径  15-16
    1.5.2 MAPK信号转导途径  16-17
    1.5.3 TLRs信号转导途径  17-18
    1.5.4 RIG-Ⅰ/MDA-5信号通路  18-19
  1.6 反式报告系统  19-21
第2章研究目的与意义  21-22
第3章材料与方法  22-32
  3.1 试验材料  22-24
    3.1.1 毒株、细胞与菌种  22
    3.1.2 载体与质粒  22-23
    3.1.3 工具酶和试剂  23
    3.1.4 抑制剂及其配制  23
    3.1.5 培养基与抗生素及其配制  23-24
    3.1.6 缓冲液  24
  3.2 试验方法  24-32
    3.2.1 PRRSV的扩增和紫外灭火  24-25
    3.2.2 半数细胞培养物感染量(TCID_(50))的测定  25
    3.2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)  25
    3.2.4 连接产物的转化  25-26
    3.2.5 质粒的制备与鉴定  26-28
    3.2.6 质粒转染  28
    3.2.7 细胞、感染病毒的细胞样品总RNA的提取  28-29
    3.2.8 cDNA的合成  29-30
    3.2.9 SYBR Green Ⅰ实时定量PCR  30
    3.2.10 相对mRNA表达水平的计算  30
    3.2.11 双荧光素酶检测实验  30-31
    3.2.12 统计学分析  31-32
第4章结果与分析  32-40
  4.1 PRRSV感染激活RANTES的转录  32-34
    4.1.1 Real-time PCR检测PRRSV感染激活RANTES的转录  32
    4.1.2 荧光素酶报告系统检测PRRSV感染激活RANTES的产生  32-33
    4.1.3 PRRSV感染激活RANTES与病毒的感染剂量相关  33-34
  4.2 PRRSV感染激活RANTES产生的转录因子的确定  34-35
    4.2.1 参与调控RANTES基因转录的启动子区域的分析  34
    4.2.2 IRF与PRRSV感染诱导RANTES的转录无关  34-35
  4.3 PRRSV感染激活RANTES产生的相关信号通路  35-40
    4.3.1 PRRSV感染激活RANTES的产生与NF-κB通路有关  35-37
    4.3.2 PRRSV感染Marc-145细胞激活MAPK信号通路  37
    4.3.3 PRRSV感染激活RANTES的产生与ERK1/2通路有关  37-40
第5章讨论与结论  40-45
  5.1 讨论  40-44
    5.1.1 PRRSV感染激活RANTES的产生  40
    5.1.2 参与调控RANTES产生的转录因子  40-42
    5.1.3 PRRSV感染激活RANTES产生的上游信号通路  42-44
  5.2 结论  44-45
参考文献  45-51
致谢  51

PRRSV感染激活RANTES产生的信号通路研究

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