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拟南芥PPR蛋白EMS15功能的初步研究

作　者: 张国瑞
导　师: 杨仲南
学　校: 上海师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 拟南芥叶绿体 PPR蛋白多顺反子裂解 PEP聚合酶
分类号: Q946.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

拟南芥(Arabidopsis thaliana)白化突变体ems15经EMS化学诱变法得到。遗传分析表明该突变株系为核基因控制的单基因隐性突变。突变体的表型为植株白化，苗期致死。叶绿体超微结构分析显示ems15突变体的叶绿体空泡化严重，几乎不含类囊体片层结构。利用图位克隆和基因测序分析发现AT4G18520发生了终止突变，经遗传互补及等位分析确认了AT4G18520突变导致了ems15的白化突变表型。EMS15基因编码的蛋白是一个PPR蛋白家族成员，其蛋白序列中间包含包括P、L、S在内的14个连续的PPR基序，属于PLS亚家族。亚细胞定位显示该蛋白定位于叶绿体中。序列比对及进化分析表明该蛋白在不同物种中均有其同源物，进化上比较保守。利用RT-PCR和Real-Time PCR分析该基因的表达模式发现该基因在根、茎、叶、花和幼苗中均有表达，而在叶中的表达量最高。已知多数PPR蛋白参与对质体基因的表达调控。为了探究EMS15基因对叶绿体基因表达的影响，我们利用RT-PCR分析EMS15对叶绿体中前体mRNA内含子剪接的影响，结果显示部分叶绿体基因如trnK、petB、petD等的内含子剪接效率明显低于野生型。同时我们也检测了EMS15对叶绿体多顺反子的切割情况，发现EMS15对叶绿体基因组编码的RNA聚合酶（PEP）亚基rpoA的切割效率明显下降。EMS15可能参与叶绿体基因表达的多种调控过程，其中的分子机理尚需进一步研究。

全文目录

中文摘要  5-6
Abstract  6-10
1.引言  10-26
  1.1 叶绿体起源学说  10-11
    1.1.1 内共生起源学说  10-11
    1.1.2 非共生起源学说  11
  1.2 叶绿体的发生、结构与功能  11-14
    1.2.1 叶绿体的发生  11-12
    1.2.2 叶绿体的形态结构与功能  12-14
  1.3 拟南芥叶绿体基因组结构与表达调控  14-18
    1.3.1 拟南芥基因组中的多顺反子  16-17
    1.3.2 拟南芥叶绿体基因组中依赖NEP 和依赖PEP的基因  17-18
    1.3.3 叶绿体基因组中的内含子  18
  1.4 PPR蛋白家族  18-26
    1.4.1 PPR 家族蛋白的特征  19-20
    1.4.2 PPR 蛋白家族的分类  20-22
    1.4.3 PPR 基因的分布  22-23
    1.4.4 PPR 蛋白在细胞中的定位分布分析  23-24
    1.4.5 PPR 蛋白的分子功能  24-26
2 材料与方法  26-47
  2.1 材料  26-29
    2.1.1 植物材料  26
    2.1.2 主要仪器  26-27
    2.1.3 菌株、质粒  27
      2.1.3.1 菌株  27
      2.1.3.2 质粒载体  27
    2.1.4 抗生素  27-28
    2.1.5 培养基配方  28
    2.1.6 其它  28-29
  2.2 实验方法  29-47
    2.2.1 拟南芥种植、转化与转基因植株的筛选  29-30
      2.2.1.1 拟南芥无菌培养  29
      2.2.1.2 拟南芥土壤种植与农杆菌转化  29-30
      2.2.1.3 转基因植株的筛选  30
    2.2.2 T-DNA 插入突变体的鉴定  30
    2.2.3 热击感受态E.coli 制备  30-31
    2.2.4 大肠杆菌的转化  31-32
    2.2.5 制备农杆菌感受态细胞  32
    2.2.6 农杆菌的转化过程  32
    2.2.7 克隆后载体的鉴定  32
    2.2.8 质粒DNA 的少量制备碱裂解法  32-33
    2.2.9 小量酶切鉴定体系  33
    2.2.10 连接片段或载体的体系  33-34
    2.2.11 载体构建  34-35
      2.2.11.1 互补载体的构建  34
      2.2.11.2 亚细胞定位载体的构建  34-35
    2.2.12 DNA 和RNA 的抽取  35-36
      2.2.12.1 DNA 的抽取  35-36
      2.2.12.2 RNA 的抽取  36
    2.2.13 RT-PCR 和Real-Time PCR  36-38
      2.2.13.1 RNA 反转录合成cDNA 第一链  36-37
      2.2.13.2 半定量PCR  37-38
    2.2.14 原生质体导入亚细胞定位GFP 载体方法  38-40
    2.2.15 透射电镜观察  40
    2.2.16 免疫印迹杂交（Western Blot  40-42
    2.2.17 RNA 印迹杂交（Northern Blot  42-47
3.结果与讨论  47-60
  3.1 拟南芥白化突变体ems15 及等位分析  47-48
  3.2 ems15突变体的遗传互补实验  48
  3.3 ems15突变体的表型分析  48-49
  3.4 ems15突变体的超微结构分析  49-50
  3.5 EMS15序列分析和蛋白质的亚细胞定位  50-52
  3.6 EMS15蛋白定位于叶绿体中  52-53
  3.7EMS15基因的表达模式  53-54
  3.8 EMS15表达产物对叶绿体基因内含子剪切的影响  54-55
  3.9 EMS15对叶绿体多顺反子前体RNA 裂解的影响  55-56
  3.10 EMS15 对叶绿体蛋白的影响  56-57
  3.11 讨论  57-60
    3.11.1 EMS15基因是拟南芥叶绿体的正常发生与发育的必需基因  57-58
    3.11.2 EMS15是PPR 蛋白家族的成员  58
    3.11.3 EMS15突变影响多顺反子中pro-rpoA 的正常裂解  58-60
参考文献  60-65
致谢  65

拟南芥PPR蛋白EMS15功能的初步研究

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