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家蚕BmeIF4E基因的克隆、表达及功能分析

作　者: 韩剑秋
导　师: 于威；张耀洲
学　校: 浙江理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 家蚕 真核细胞翻译起始因子4E 实时荧光定量PCR 亚细胞定位 RNAi
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


我们从本实验室构建的家蚕蛹cDNA文库中发现一条EST序列,在NCBI的GenBank数据库中进行比对,结果发现该序列与其他物种的真核细胞翻译起始因子4E基因具有较高的相似性,推测可能是编码家蚕eIF4E蛋白的基因。然后通过RT-PCR技术从家蚕蛹中获得该基因的全长序列,并将该基因命名为BmeIF4E(Bombyx mori eukaryotic translation initiation factor 4E)基因,GenBank登录号为DN443192。生物信息学分析表明,该序列全长1445 bp,包含633 bp组成的ORF框,编码210个氨基酸残基,等电点为5.97,预测分子量为24.44 kD,并含有一个IF4E超家族保守结构域。同源性比较结果表明该基因编码蛋白质的氨基酸序列与草地夜蛾(AF281654)的同源性达到91%。为研究BmeIF4E的功能,将该基因克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a(+)中,构建原核表达质粒pET-28a(+)-BmeIF4E,转化感受态细胞E.coli BL21 (DE3),筛选阳性克隆,重组菌经IPTG诱导后菌体裂解物利用SDS-PAGE检测,与阴性对照相比在28 kD处有一特异性条带。由于表达的融合蛋白既存在于上清中,也存在于沉淀中,因此利用菌体超声破碎后的上清直接利用镍亲和柱纯化融合蛋白。经FPLC反相柱层析进一步纯化后,进行质谱分析,结果显示该融合蛋白的分子量为27.87 kD,与理论值28 kD(融合标签3.56 kD,BmeIF4E 24.44 kD)基本相符。以纯化所得蛋白为抗原免疫新西兰兔制备多克隆抗体,ELISA检测该抗体血清的效价大于1:12800。同时,利用荧光定量PCR和Western blot的方法分析了不同发育时期及五龄幼虫各组织中BmeIF4E基因的表达差异,定量内参选用β-actin,结果显示在卵、五龄幼虫、蛹和蛾四个发育时期中,蛾中的表达量最高,其次是蛹,再次是五龄幼虫,而在卵中表达量很少;各组织中BmeIF4E表达量从高到底依次是马氏管、表皮、脂肪体、气管、卵巢、中肠、头和丝腺。以上研究结果表明,BmeIF4E作为一种重要的管家基因,在家蚕的整个生命周期中均起着非常重要的作用。家蚕Bm5细胞中进行亚细胞定位研究结果表明BmeIF4E既存在于细胞质中也存在于细胞核中。此外,以BmeIF4E基因的ORF为模板体外转录合成dsRNA,脂质体包埋转染Bm5细胞,72 h后提取细胞总蛋白做Western blot检测RNAi情况,发现干扰后细胞总蛋白中BmeIF4E蛋白含量明显低于阴性对照组。MTT法检测结果表明,干扰后细胞活力也明显下降。

全文目录


摘要  7-8
Abstract  8-14
缩略语  14-15
第一章 eIF4E 的研究进展  15-24
  1 前言  15
  2 eIF4E 的发现及其家族成员  15-16
  3 eIF4E 的结构  16-17
  4 生物学功能  17-19
    4.1 eIF4E 和帽依赖mRNA 的翻译  17-18
    4.2 eIF4E 和核质转运  18
    4.3 eIF4E 与无帽病毒mRNA 的翻译  18-19
  5 eIF4E 的活性调节机制  19-21
    5.1 eIF4E 磷酸化  19-20
    5.2 eIF4E 抑制蛋白的磷酸化  20
    5.3 eIF4E 的基因调控  20-21
  6 eIF4E与肿瘤  21-22
  7 展望  22-24
第二章 实验方案设计  24-26
  1 研究目的和意义  24
  2 研究内容  24-25
  3 实验流程图  25-26
第三章 生物信息学分析  26-35
  1 生物信息学工具  26
  2 方法  26-27
  3 结果  27-33
    3.1 BmeIF4E 基因的序列  27-28
    3.2 BmeIF4E 基因内含子与外显子分析  28
    3.3 疏水性分析  28-29
    3.4 跨膜区预测分析  29
    3.5 信号肽分析  29-30
    3.6 BmeIF4E 在细胞中定位的分析  30-31
    3.7 BmeIF4E 的二级结构预测  31
    3.8 BmeIF4E 的高级结构预测  31-32
    3.9 BmeIF4E 氨基酸序列的同源性分析  32
    3.10 进化树的构建  32-33
  4 讨论  33-35
第四章 BmeIF4E 基因的克隆、表达、纯化及抗体制备  35-59
  1 试剂与材料  35-42
    1.1 材料与设备  35
    1.2 试剂  35-36
    1.3 主要试剂的配制  36-42
      1.3.1 大肠杆菌培养基  36
      1.3.2 抗生素  36
      1.3.3 碱裂解法提取质粒DNA 用溶液  36-37
      1.3.4 核酸电泳所用溶液  37-38
      1.3.5 测序用溶液  38
      1.3.6 SDS-PAGE 用溶液  38-39
      1.3.7 镍柱亲和层析纯化用试剂  39
      1.3.8 反相FPLC 纯化用试剂  39
      1.3.9 Bradford 检测用试剂  39-40
      1.3.10 抗体制备用试剂  40
      1.3.11 ELISA 用溶液  40-41
      1.3.12 抗体纯化用试剂  41
      1.3.13 Western blot 用试剂  41-42
  2 方法  42-53
    2.1 BmeIF4E 基因的克隆  42-46
      2.1.1 家蚕蛹总RNA 的提取  42
      2.1.2 cDNA 第一链的合成  42
      2.1.3 PCR 扩增  42-43
      2.1.4 PCR 产物与表达载体pET-28a(+)的双酶切  43
      2.1.5 酶切产物的纯化  43-44
      2.1.6 连接反应  44
      2.1.7 E.coli 感受态细胞的制备（CaC1_2 法）[61]  44
      2.1.8 连接产物的转化  44-45
      2.1.9 重组克隆的筛选与鉴定  45-46
    2.2 BmeIF4E 基因序列的测定  46-47
    2.3 重组质粒的转化及鉴定  47
    2.4 重组质粒在大肠杆菌中的表达  47
    2.5 SDS-PAGE 电泳分析  47-48
    2.6 镍亲和柱纯化融合蛋白  48-49
    2.7 融合蛋白的FPLC 纯化和分子量的质谱鉴定  49
      2.7.1 融合蛋白的FPLC 纯化  49
      2.7.2 融合蛋白分子量的质谱鉴定  49
    2.8 抗体制备  49-51
      2.8.1 Bradford 法测蛋白含量  49-50
      2.8.2 抗原制备  50
      2.8.3 免疫动物  50-51
      2.8.4 多克隆抗血清制备  51
    2.9 间接ELISA 法测定多克隆抗血清效价  51-52
    2.10 抗体的纯化  52
    2.11 Western blot 检测抗体特异性  52-53
  3 结果  53-58
    3.1 家蚕蛹总RNA 琼脂糖电泳检测  53
    3.2 RT-PCR 扩增BmeIF4E 基因完整的ORF 序列  53
    3.3 重组质粒pET-28a(+)-BmeIF4E 双酶切鉴定  53-54
    3.4 重组质粒pET-28a(+)-BmeIF4E 的序列测定  54
    3.5 重组蛋白BmeIF4E 在E.coli BL21 (DE3)中诱导表达及纯化  54-55
    3.6 FPLC 分离纯化重组蛋白BmeIF4E  55
    3.7 质谱鉴定重组蛋白BmeIF4E  55-56
    3.8 抗BmeIF4E 的多克隆抗体的纯化  56-57
    3.9 抗BmeIF4E 的多克隆抗体效价测定  57
    3.10 Western blot 检测  57-58
  4 讨论  58-59
第五章 BmeIF4E 基因的表达差异性分析  59-70
  1 材料与试剂  59-60
    1.1 材料  59
    1.2 试剂  59
    1.3 试剂配制  59-60
  2 方法  60-64
    2.1 总RNA 的提取  60-61
    2.2 DNA 酶的消化  61
    2.3 cDNA 第一链的合成  61
    2.4 荧光定量PCR 引物的设计  61-62
    2.5 荧光定量PCR  62-63
    2.6 荧光定量PCR 数据分析  63
    2.7 总蛋白质的提取及定量  63
    2.8 Western blot 检测BmeIF4E 蛋白的分布  63-64
  3 结果  64-68
    3.1 家蚕发育过程中BmeIF4E 的mRNA 量的变化  64-65
    3.2 家蚕发育过程中BmeIF4E 蛋白表达量的变化  65-66
    3.3 家蚕五龄幼虫各组织中BmeIF4E 的m RNA 量的变化  66-67
    3.4 家蚕五龄幼虫各组织中BmeIF4E 表达量的变化  67-68
  4 讨论  68-70
第六章 BmeIF4E 的亚细胞定位  70-74
  1 试剂与材料  70
    1.1 材料与设备  70
    1.2 试剂  70
  2 方法  70-71
  3 结果  71-72
  4 讨论  72-74
第七章 BmeIF4E 的RNA 干扰  74-81
  1 材料与试剂  74
    1.1 材料  74
    1.2 试剂  74
  2 方法  74-77
    2.1 合成BmeIF4E 的dsRNA  74-76
      2.1.1 获得正负链RNA 的转录模板  74-75
      2.1.2 合成dsRNA  75-76
    2.2 测定dsRNA 的浓度  76
    2.3 Bm5 细胞的转染  76
    2.4 Western blot 检测RNA 干扰前后BmeIF4E 蛋白含量的变化  76-77
      2.4.1 细胞蛋白的提取及定量  76-77
      2.4.2 Western blot 检测  77
    2.5 MTT 法检测细胞活力变化  77
  3 结果  77-79
    3.1 dsRNA 的合成  77-78
    3.2 dsRNA 的定量  78
    3.3 Western blot 检测 BmeIF4E 的干扰效果  78-79
    3.4 MTT 法检测细胞活力  79
  4 讨论  79-81
结论  81-82
参考文献  82-86
致谢  86-87
在学期间发表的论文  87

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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