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四环素诱导表达NF-kB信号通路抑制因子p65RHD在猪血管内皮细胞中的研究

作　者: 桂端
导　师: 龙良启
学　校: 华中农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: NF-κB沼信号通路 p65RHD 猪血管内皮细胞四环素诱导系统异种移植排斥反应
分类号: Q819
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

由于目前世界上供体器官严重的不足,异种器官移植逐渐发展成为一项热门研究。猪作为人类器官移植的理想供体已在世界上获得一致认可,它不仅与人类进化关系近,更重要的是器官大小相当而且经济、量大。猪的器官直接移植人体会导致免疫排斥反应。其中,血管内皮细胞的激活是异种移植中产生的一个普遍现象。为了抑制血管内皮细胞的激活,本实验构建了一个缺乏转录活性的NF-κB的亚基p65/RelA。当内皮细胞被激活时,该转录因子主要诱导粘附因子、细胞活素及促凝血因子的表达。p65RHD蛋白缺少转录活性,但是由于保留了RelA亚基的Rel同源域,仍然具有二聚结合,DNA锚定和核定位的功能,因此能竞争性抑制NF-κB信号通路。通过本实验的结论,p65RHD能有效的、特异的抑制蛋白NF-κB转录因子激活的一系列基因：IL-8、E-selectin,、P-selectin和组织因子。四环素诱导表达的p65RHD在内皮细胞中有同样的抑制作用。这使得用转基因动物作为异种移植的器官供体成为可能。

全文目录

摘要  6-7
ABSTRACT  7-8
1 前言  8-14
  1.1 异种移植研究的背景  8-10
    1.1.1 异种移植的技术问题  8-9
    1.1.2 异种移植所面临困难的解决途径  9-10
  1.2 NF-κB信号通路  10
  1.3 LPS引起血管内皮细胞的激活  10
  1.4 抑制NF-κB信号通路的方法  10-11
  1.5 检测NF-κB信号通路激活的方法  11-12
  1.6 四环素诱导表达系统  12
  1.7 增强型绿色荧光蛋白  12-14
2 材料与方法  14-36
  2.1 试验材料  14-16
    2.1.1 主要试剂  14
    2.1.2 主要仪器  14-15
    2.1.3 主要试剂的配制  15
    2.1.4 主要分析软件  15-16
  2.2 实验方法  16-36
    2.2.1 PIEC p65基因的克隆  16-20
    2.2.2 p65RHD的克隆  20-22
    2.2.3 ICAM-2启动子及内含子的克隆  22-23
    2.2.4 TRE元件的克隆  23-25
    2.2.5 载体信息介绍  25-28
    2.2.6 p65RHD片段与pIRES2-EGFP载体的连接  28-29
    2.2.7 TRE片段与pIRES2-p65RHD-EGFP载体的连接  29
    2.2.8 转染用无内毒素质粒的提取  29-30
    2.2.9 细胞实验  30-33
    2.2.10 四环素诱导表达系统的试验  33-36
3 结果与分析  36-48
  3.1 载体构建  36-44
    3.1.1 PIEC p65基因的克隆  36-44
  3.2 细胞实验  44-48
    3.2.1 猪动脉血管内皮细胞(PIEC)(PIEC)  44
    3.2.2 PCRIE转染观察  44-45
    3.2.3 LPS刺激猪动脉血管内皮细胞(PIEC)NF-κB信号通路激活的研究  45
    3.2.4 p65RHD的过表达抑制NF-κB信号通路的实验  45-46
    3.2.5 四环素诱导表达实验  46-48
4 讨论  48-50
5 结论  50-51
参考文献  51-56
致谢  56

四环素诱导表达NF-kB信号通路抑制因子p65RHD在猪血管内皮细胞中的研究

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