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SVEC中CSFV差异基因的鉴定、cDNA序列的延伸及shRNA抑制CSFV在PK-15细胞中增殖的研究

作　者: 冶贵生
导　师: 张彦明
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪瘟病毒 猪血管内皮细胞 差异基因 小发卡RNA NS3基因
分类号: S852.65
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


猪瘟病毒具有对猪专一性致病的特性,病毒虽能在多种体外培养的猪源细胞中增殖,但只引起猪血管内皮细胞(SVEC)发生细胞病变效应(CPE),而被感染的其他细胞不能够产生眼观的病理变化。产生这种现象的原因可能是猪血管内皮细胞被猪瘟病毒感染后刺激某种/某些敏感基因(我们将其称之为猪瘟病毒“敏感基因”)表达了某种/某些蛋白酶,将猪瘟病毒的p125蛋白裂解成为p80蛋白所致。本文在前期研究工作的基础上,采用RNA干扰技术,对11个候选猪瘟病毒“敏感基因”中的4个基因采用生物学软件对每一条基因设计、合成不同位置的shRNA干扰序列,以载体法介导实现shRNA分子在内皮细胞中的有效转录,筛选、鉴定差异基因的功能,为猪瘟病毒对猪专一性致病机理的研究提供科学资料。以RACE法延伸差异基因的编码序列,为差异基因在PK-15细胞中的表达及功能研究提供序列基础。将靶向猪瘟病毒NS3基因的shRNA重组干扰表达载体导入PK-15细胞中,为猪瘟病毒的抗感染以及基因功能的研究奠定基础。本研究获得了以下结果:1.应用在线RNA干扰设计软件针对4个差异基因中每一条基因设计不同位置的小发卡RNA干扰序列,合成这些序列,并退火连接为双链干扰片段,将双链干扰片段定向克隆到RNA干扰载表达体中,转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,对转化产物进行卡那霉素筛选,碱裂解法提取重组质粒,将酶切鉴定为阳性的质粒进行核苷酸序列的测序,序列结果表明,重组载体构建成功,插入的干扰序列位置、大小、序列均正确。鉴定为阳性的重组质粒纯化后转染体外分离培养的猪血管内皮细胞,接种猪瘟病毒石门株并与不同时间断观察内皮细胞的病变情况。结果表明,转染了靶向差异基因Y8的shRNA重组干扰载体的内皮细胞,相对于对照细胞及其他的差异基因转染组,细胞的形态较好、存活率较高,差异基因Y8可能是所寻找的与猪瘟病毒致内皮细胞病变有关的“敏感基因”。2.为了验证差异基因Y8能否使猪瘟病毒致对PK-15产生细胞病变效应,以5’端标记磷酸基团的反转录引物反转录差异基因Y8的cDNA序列,然后用两对反式PCR引物以环化的cDNA序列模板进行5’端上游未知序列的扩增。以特异性上游引物与3’接头引物对差异基因Y8的cDNA序列3’端下游未知序列进行延伸。扩增的目的片断在T4 DNA酶的作用,分别连接到pMD18-T与pMD19-T simple vector载体中,转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,挑取的重组质粒经酶切鉴定后进行核苷酸序列的测序。结果表明,通过5’RACE与3’RACE分别对差异基因Y8的cDNA序列5’端上游未知序列及3’端下游未知序列进行了延伸。3.应用软件分析猪瘟病毒NS3基因,设计针对NS3基因不同位置的小发卡RNA干扰序列,化学合成这些序列,并退火连接为双链干扰片段,将双链干扰片段定向克隆到pGenesil-1 RNA干扰表达载体中,构建重组载体pGene-NS3-1、pGene-NS3-2、pGene-NS3-3及阴性对照pGene-NS3-Neg,转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,对转化产物进行卡那霉素筛选,碱裂解法提取重组质粒,将酶切、测序鉴定为阳性的重组干扰载体经Plasmid mini kit纯化后在脂质体的作用下转染PK-15细胞。G418抗性筛选获得稳定转染的阳性细胞,克隆细胞扩大培养后,接种猪瘟病毒Shimen株,72h时收集细胞分别进行实时定量PCR和ELISA光吸收度分析。Real-time PCR分析表明,pGene-NS3-1、pGene-NS3-2、pGene-NS3-3转录产生的shRNA分子与对照细胞比较,均在一定程度上沉默了病毒基因;ELISA检测结果表明,转染pGene-NS3-1、pGene-NS3-2、pGene-NS3-3重组载体的PK-15细胞均在不同程度上抑制了猪瘟病毒粒子的增殖。

全文目录


摘要  5-7
ABSTRACTS  7-13
前言  13-14
第一章 RNA 干扰研究进展  14-33
  1.1 RNA 干扰研究的历史背景  14-15
  1.2 RNAi 的作用机制  15-18
    1.2.1 siRNA  16
    1.2.2 Dicer 酶  16-17
    1.2.3 RISC  17
    1.2.4 RdRp  17-18
  1.3 RNAi 的作用特点  18-19
    1.3.1 特异性  18
    1.3.2 高效性  18
    1.3.3 转移性  18
    1.3.4 稳定性好  18
    1.3.5 设计、操作简便  18-19
  1.4 siRNA 的设计及修饰  19-21
  1.5 siRNA 分子的制备  21-22
    1.5.1 化学合成法  21
    1.5.2 体外转录法  21
    1.5.3 长dsRNA 酶切法  21
    1.5.4 载体介导的表达siRNA 法  21-22
    1.5.5 基于 PCR 的siRNA 表达框架法  22
  1.6 siRNA 的转染方法  22-24
    1.6.1 磷酸钙法  22
    1.6.2 电穿孔法  22-23
    1.6.3 DEAE-葡聚糖法  23
    1.6.4 阳离子脂质体法  23
    1.6.5 显微注射法  23
    1.6.6 阳离子聚合物法  23
    1.6.7 病毒载体导入法  23-24
  1.7 RNAi 的应用  24-33
    1.7.1 基因功能的研究  24-25
    1.7.2 抗病毒感染  25-29
    1.7.3 基因治疗  29-30
    1.7.4 信号传导研究的应用  30-31
    1.7.5 干细胞中的应用  31-33
第二章 猪瘟病毒研究进展  33-40
  2.1 CSFV 病毒粒子的形态学、理化以及细胞培养特性研究  33-34
  2.2 CSFV 基因组研究  34-35
  2.3 CSFV 功能基因研究  35-37
  2.4 CSFV 与宿主细胞的相互作用及其致病机制  37-40
第三章 猪瘟病毒差异基因的筛选与鉴定  40-60
  3.1 材料  40-44
    3.1.1 猪脐静脉血管内皮细胞分离与培养所需材料及相关试剂  40-42
    3.1.2 菌株及毒株  42
    3.1.3 siRNA 重组干扰表达载体构建与鉴定所需相关材料及试剂  42-43
    3.1.4 仪器设备  43-44
  3.2 方法  44-53
    3.2.1 猪脐静脉血管内皮细胞的分离培养  44-45
    3.2.2 靶向猪瘟病毒差异基因shRNA 干扰载体的构建与鉴定  45-52
    3.2.3 重组干扰表达载体转染猪脐静脉内皮细胞  52
    3.2.4 shRNA 沉默CSFV 差异基因后猪瘟病毒致SVEC 病变效应  52-53
  3.3 结果  53-57
    3.3.1 分离培养的猪脐静脉血管内皮细胞  53
    3.3.2 重组干扰质粒的鉴定结果  53-54
    3.3.3 重组干扰载体转录的shRNA 对内皮细胞的影响  54
    3.3.4 shRNA 沉默CSFV 差异基因后猪瘟病毒致SVEC 病变效应  54-57
  3.4 讨论  57-59
  3.5 小结  59-60
第四章 猪瘟病毒差异基因cDNA 序列的延伸  60-80
  4.1 材料  60-62
    4.1.1 毒株、菌株、细胞  60
    4.1.2 主要试剂  60-61
    4.1.3 细胞培养所需溶液  61
    4.1.4 ATV 消化液  61
    4.1.5 引物设计  61-62
    4.1.6 主要仪器  62
  4.2 方法  62-70
    4.2.1 猪瘟病毒接种猪血管内皮细胞  62
    4.2.2 细胞总 RNA 的提取  62-63
    4.2.3 RNA 的纯化  63
    4.2.4 猪瘟病毒差异基因5’末端未知序列的延伸  63-67
    4.2.5 猪瘟病毒差异基因3’末端未知序列的延伸  67-70
  4.3 结果  70-77
    4.3.1 5’RACE PCR 扩增结果  70
    4.3.2 5’RACE 酶切鉴定结果  70-71
    4.3.3 5’RACE 获得的序列  71
    4.3.4 3’RACE PCR 扩增结果  71
    4.3.5 3’RACE 酶切鉴定结果  71
    4.3.6 3’RACE 获得的序列  71-72
    4.3.7 序列拼接及同源性分析  72-77
  4.4 讨论  77-78
  4.5 小结  78-80
第五章 载体介导的shRNA 抑制猪瘟病毒在 PK15 细胞中增殖  80-96
  5.1 材料  80-82
    5.1.1 毒株，菌株、细胞与载体  80
    5.1.2 工具酶及相关试剂  80-81
    5.1.3 细胞培养所需溶液  81
    5.1.4 D-Hank’s 缓冲液  81
    5.1.5 ATV 消化液  81
    5.1.6 主要仪器  81-82
  5.2 方法  82-90
    5.2.1 特异性干扰序列的设计  82-83
    5.2.2 pGene-NS3-1 干扰片断的退火  83
    5.2.3 pGenesil-1 表达载体的酶切  83
    5.2.4 重组表达载体酶切产物的纯化回收  83-84
    5.2.5 退火后的pGene-NS3-1 干扰片断与表达载体酶切产物的连接  84
    5.2.6 连接产物的转化  84-85
    5.2.7 pGene-NS3-1 重组质粒的提取与鉴定  85-86
    5.2.8 pGene-NS3-1 重组干扰载体的序列测定  86
    5.2.9 重组干扰载体转染级别的纯化  86
    5.2.10 PK-15 细胞的复苏与培养  86
    5.2.11 G418 真核细胞最佳筛选浓度的测定  86
    5.2.12 重组干扰载体转染 PK-15 细胞  86-87
    5.2.13 阳性克隆细胞的筛选与扩大培养  87
    5.2.14 猪瘟病毒接种阳性细胞  87
    5.2.15 猪瘟病毒基因的 Real-Time PCR 检测  87-89
    5.2.16 猪瘟病毒粒子的 ELISA 分析  89-90
  5.3 结果  90-93
    5.3.1 重组干扰载体的酶切鉴定  90
    5.3.2 G418 最佳筛选浓度结果  90
    5.3.3 阳性克隆细胞的筛选结果  90-91
    5.3.4 扩大培养的阳性克隆细胞  91-92
    5.3.5 猪瘟病毒基因的实时定量 PCR 分析结果  92-93
    5.3.6 猪瘟病毒粒子的 ELISA 检测分析结果  93
  5.4 讨论  93-95
  5.5 小结  95-96
结论  96-97
参考文献  97-109
致谢  109-110
作者简介  110-111
附录  111-113

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
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