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猪瘟Shimen株致猪血管内皮细胞病变前后表达差异基因寻找及E2基因PK-15细胞表达

作　者: 张永国
导　师: 张彦明
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 猪瘟 猪血管内皮细胞 致病机理 差异显示技术 E2基因 真核表达
分类号: S852.65
类　型: 博士论文
年　份: 2005年
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内容摘要


猪瘟(Classical Swine Fever,CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的猪急性高度接触性传染性疾病,是严重威胁养猪业,具有重要经济意义的病毒性疾病之一,猪瘟可引起猪的全身组织器官弥漫性出血,小血管和毛细血管内皮细胞发生变性、坏死。猪瘟病毒为黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)成员,基因组大小约12.3kb,含一个大的开放阅读框(ORF),由11 个编码结构蛋白与非结构蛋白的基因组成。猪瘟病毒对血管组织具有亲嗜性,病理组织学检查时发现,组织器官的出血斑点主要是由于小血管和毛细血管内皮细胞发生肿胀、变性和坏死;梗死灶的发生主要是由于小动脉管内皮细胞发生变性、坏死、剥脱后,血管内膜粗糙,官腔内血栓形成,导致官腔狭窄或闭塞所致。此外,还可见到心肌呈实质变性,但病猪的肾脏等器官的实质细胞没有变性、坏死等病理变化。而目前在体外增殖猪瘟病毒利用的培养细胞大多数是猪肾细胞(如PK–15、PK–2a、SK–6等),其他还有猪肺、脾、睾丸、骨髓细胞等。这些细胞即使在猪瘟病猪体内都不会发生病理变化,所以在体外受CSFV 感染时不产生CPE也是理所当然的。病理组织学观察发现猪血管内皮细胞在猪瘟感染猪后发生明显的细胞病变,建立猪血管内皮细胞体外培养方法,观察猪瘟病毒感染猪血管内皮细胞致细胞病变后的细胞形态变化和细胞器的变化,探讨猪瘟病毒致猪血管内皮细胞病变的机理。猪瘟病毒E2基因编码的gp55 蛋白是猪瘟病毒的主要保护性抗原,是目前研制猪瘟基因工程疫苗的首选基因。采用来源于猪的PK–15 细胞做为受体细胞,利用哺乳动物细胞表达载体表达E2基因,一方面可充分利用受体细胞遗传密码子的嗜好性,提高重组蛋白的表达量,另一方面因为PK–15 细胞来源于猪,后加工与其他表达宿主相比具有无比的优越性,其免疫原性和疫苗的免疫保护力可望得到很大提高,为猪瘟病毒基因工程疫苗投入实际应用奠定基础。本研究由三部分构成,第一部分是建立猪脐静脉血管内皮细胞的培养方法,利用猪瘟病毒Shimen株感染猪脐静脉血管内皮细胞,研究猪瘟Shimen 株致细胞病变效应后的形态变化和细胞器的变化,初步探讨了猪瘟病毒致猪血管内皮细胞病变的分子基础。第二部分利用DDRT–PCR技术分析了猪瘟Shimen 株致猪脐静脉血管内皮细胞病变前后表达差异的基因,共发现了推测为猪瘟Shimen 株致猪血管内皮细胞病变的11条敏感基因。第三部分是利用PK–15 细胞作为受体细胞,表达猪瘟病毒E2基因,为建立以重组蛋白为抗原的猪瘟病毒检测方法和猪瘟基因工程疫苗的应用奠定基础。主要试验和结果如下: 1.选用I 型胶原酶,采用Jaffe 式灌流法成功的分离和培养了猪脐静脉血管内皮细胞。扫描电镜观察和第Ⅷ因子相关抗原(F-ⅧR Ag)检测阳性,证明分离培养的细胞为血

全文目录


中文摘要  5-7
英文摘要  7-14
文献综述  14-55
  第一章 猪瘟及猪瘟病毒的研究进展  14-39
    1.1 猪瘟的研究进展  14-19
      1.1.1 猪瘟概述  14-15
      1.1.2 猪瘟的流行病学和临床症状  15-17
      1.1.3 猪瘟病毒的细胞培养  17
      1.1.4 CSFV 的侵入及其在体内的增殖  17-18
      1.1.5 猪瘟的诊断和防制  18-19
    1.2 猪瘟病毒的形态及理化特性  19-20
    1.3 CSFV 的分子生物学研究进展  20-29
      1.3.1 CSFV 的基因组结构  20-21
      1.3.2 CSFV 基因组全序列研究概述  21-22
      1.3.3 CSFV 的5′-NCR 和3′-NCR 结构  22-24
      1.3.4 CSFV 多聚蛋白的翻译与加工  24-26
      1.3.5 CSFV 基因组编码的蛋白质及其功能  26-29
    1.4 CSFV 的分子免疫学研究进展  29-32
    1.5 猪瘟病毒的致病机理  32-39
      1.5.1 猪瘟病毒与宿主细胞的相互作用  32-33
      1.5.2 致细胞病变型CSFV  33-36
      1.5.3 NS3 基因在病毒的复制及病毒与宿主细胞关系中的作用  36-39
  第二章 差异显示技术及血管内皮细胞的体外培养研究进展  39-50
    2.1 基因表达研究方法  39-41
      2.1.1 Northern 杂交法  39
      2.1.2 S1 核酸酶保护法  39
      2.1.3 差减杂交技术  39-41
      2.1.4 差异显示法  41
    2.2 差异显示逆转录PCR 法  41-45
      2.2.1 DDRT-PCR 方法的基本原理  41
      2.2.2 DDRT-PCR 的引物设计  41-43
      2.2.3 DDRT-PCR 的的使用策略  43-45
        2.2.3.1 实验材料的选择  43
        2.2.3.2 RNA 的提取  43
        2.2.3.3 DDRT-PCR 的逆转录  43
        2.2.3.4 DDRT-PCR 的PCR  43-44
        2.2.3.5 差异条带的回收和再扩增  44-45
        2.2.3.6 差异片段的筛选鉴定、克隆、顺序  45
        2.2.3.7 全基因序列的获得  45
      2.2.4 DDRT-PCR 的展望  45
    2.3 血管内皮细胞培养的发展简况  45-50
      2.3.1 血管内皮细胞体外培养的应用  46-47
        2.3.1.1 血管内皮细胞的结构  46-47
        2.3.1.2 血管内皮细胞的功能  47
      2.3.2 血管内皮细胞培养的特性  47-48
        2.3.2.1 体外培养内皮细胞的来源  47-48
        2.3.2.2 体外培养内皮细胞的形态结构  48
      2.3.3 体外培养内皮细胞的条件  48-50
        2.3.3.1 常用的合成培养基  48-49
        2.3.3.2 血清  49
        2.3.3.3 促生长因子  49-50
  第三章 猪瘟基因工程疫苗的研究进展  50-55
    3.1 猪瘟传统疫苗研究  50
    3.2 猪瘟基因工程疫苗研究的意义  50-51
    3.3 猪瘟基因工程疫苗研究的进展  51-55
试验研究  55-127
  第四章 猪瘟Shimen 株对猪血管内皮细胞的致病变作用  55-86
    4.1 材料  56-58
      4.1.1 细胞培养用材料和毒株  56
      4.1.2 细胞培养基  56
      4.1.3 细胞培养用溶液  56-57
      4.1.4 检测用试剂  57-58
      4.1.5 主要仪器设备  58
      4.1.6 引物的设计与合成  58
    4.2 方法  58-63
      4.2.1 猪脐静脉血管内皮细胞的分离培养及鉴定  58-60
        4.2.1.1 培养液的准备  58
        4.2.1.2 猪脐静脉血管内皮细胞的分离  58-59
        4.2.1.3 脐静脉血管内皮细胞的原代培养  59
        4.2.1.4 血管内皮细胞的传代培养  59
        4.2.1.5 血管内皮细胞的纯化  59
        4.2.1.6 血管内皮细胞生长曲线的测定  59
        4.2.1.7 血管内皮细胞的鉴定  59-60
      4.2.2 猪瘟Shimen 株致猪血管血管内皮细胞和PK-15 细胞  60
        4.2.2.1 猪脐静脉血管内皮细胞的分离培养及鉴定和PK-15 细胞复苏  60
        4.2.2.2 病毒材料的准备  60
        4.2.2.3 猪瘟病毒Shimen 猪和C-株接种猪血管内皮细胞  60
        4.2.2.4 猪瘟病毒Shimen 猪和C-株接种猪血管内皮细胞后的观察  60
        4.2.2.5 猪瘟Shimen 株和C-株接种猪血管内皮细胞的电镜观察  60
      4.2.3 猪瘟Shimen 株和C-株接种猪血管内皮细胞和PK-15 细胞后的检测  60-61
        4.2.3.1 猪瘟Shimen 株和C-株接种PK-15 细胞后的荧光检测  60
        4.2.3.2 猪瘟Shimen 株接种猪血管内皮细胞后的PCR 检测  60-61
      4.2.4 猪瘟Shimen 株致猪血管内皮细胞病变后E2 和P80 基因的检测  61-62
        4.2.4.1 毒株  61
        4.2.4.2 病毒RNA 提取  61
        4.2.4.3 RT-PCR 和nPCR  61
        4.2.4.4 扩增产物的纯化  61
        4.2.4.5 扩增产物的连接转化  61-62
        4.2.4.6 重组质粒的鉴定  62
        4.2.4.7 核酸序列测定及分析  62
      4.2.5 猪瘟Shimen 株致猪血管内皮细胞病变后DI 颗粒的检测  62-63
        4.2.5.1 样品RNA  62
        4.2.5.2 提取的样品总RNA 的鉴定  62
        4.2.5.3 探针标记  62
        4.2.5.4 探针浓度的确定  62
        4.2.5.5 杂交  62
        4.2.5.6 BCIP/NBT 显色法检测  62-63
    4.3 结果  63-81
      4.3.1 细胞形态和特征  63-64
      4.3.2 细胞生长曲线  64
      4.3.3 猪血管内皮细胞的鉴定结果  64-65
        4.3.3.1 第八因子(F-ⅧR)Ag 的检测  64
        4.3.3.2 扫描电镜观察  64-65
      4.3.4 猪瘟Shimen 株感染猪血管内皮细胞的形态特征  65-66
      4.3.5 猪瘟C-株感染猪血管内皮细胞的形态特征  66-67
      4.3.6 猪瘟Shimen 株和C-株感染PK-15 细胞的形态特征  67
      4.3.7 猪瘟Shimen 株和C-株感染猪血管内皮细胞的透射电镜观察  67-68
      4.3.8 猪瘟Shimen 株和C-株接种PK-15 细胞后的荧光检测  68-69
      4.3.9 猪瘟Shimen 株接种猪血管内皮细胞后PCR 检测  69
      4.3.10 猪瘟Shimen 株致猪血管内皮细胞病变后E2 基因的序列分析  69-73
        4.3.10.1 PCR 扩增结果  69-70
        4.3.10.2 质粒PCR 及酶切鉴定结果  70
        4.3.10.3 E2 基因的序列分析  70-73
      4.3.11 猪瘟Shimen 株致猪血管内皮细胞病变后P80 基因的序列分析  73-80
        4.3.11.1 PCR 扩增结果  73-74
        4.3.11.2 质粒PCR 及酶切鉴定结果  74
        4.3.11.3 P80 基因的序列分析  74-80
      4.3.12 猪瘟Shimen 株致猪血管内皮细胞病变后DI 颗粒的检测  80
        4.3.12.1 甲醛变性凝胶电泳  80
        4.3.12.2 杂交探针的浓度测定  80
      4.3.13 Northern 杂交结果  80-81
    4.4 讨论  81-84
    4.5 小结  84-86
  第五章 猪瘟Shimen 株致猪血管内皮细胞病变前后表达差异基因的寻找  86-115
    5.1 材料  87-88
      5.1.1 细胞和毒株  87
      5.1.2 试剂  87-88
      5.1.3 随机引物和锚定引物  88
      5.1.4 主要仪器设备  88
    5.2 方法  88-95
      5.2.1 猪瘟Shimen 株感染猪血管内皮细胞后细胞病变(CPE)的观察  88
      5.2.2 猪瘟Shimen 株感染猪血管内皮细胞病变前后RNA 提取  88-89
      5.2.3 RNA 的纯化  89
      5.2.4 cDNA 第一条链的合成  89-90
      5.2.5 PCR 反应条件的筛选  90
        5.2.5.1 PCR 反应程序的选择  90
        5.2.5.2 PCR 反应体系的选择  90
      5.2.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳  90-91
        5.2.6.1 电泳装置的安装  90-91
        5.2.6.2 制备6%聚丙烯酰胺凝胶溶液  91
        5.2.6.3 测序胶的安装  91
        5.2.6.4 加样和电泳  91
        5.2.6.5 聚丙烯酰胺凝胶染色  91
      5.2.7 聚丙烯酰胺凝胶电泳差异条带的回收  91-92
      5.2.8 差异条带的二次PCR 及电泳检测  92
      5.2.9 利用反向Northern 点杂交筛选阳性差异条带  92-93
        5.2.9.1 探针标记  92
        5.2.9.2 反向Northern 点杂交  92
        5.2.9.3 BCIP/NBT 显色  92-93
      5.2.10 纯化回收阳性差异条带的DNA 片段  93
      5.2.11 纯化产物与PMD18-T Vector 连接  93
      5.2.12 新鲜感受态细胞的制备(CaCl_2法)  93-94
      5.2.13 连接产物的转化  94
      5.2.14 重组质粒的提取  94-95
        5.2.14.1 溶液的配制  94-95
        5.2.14.2 重组质粒的提取的操作方法  95
      5.2.15 重组质粒的酶切鉴定  95
      5.2.16 序列测定  95
      5.2.17 序列同源性分析  95
    5.3 结果  95-113
      5.3.1 RNA 的提取  95-96
      5.3.2 PCR 反应条件的筛选  96-97
      5.3.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳  97-100
      5.3.4 差异条带二次PCR  100-101
      5.3.5 差异带的反向Northern 点杂交  101
      5.3.6 差异带的克隆及序列分析  101-113
        5.3.6.1 重组质粒酶切鉴定  101-102
        5.2.6.2 序列测定  102-105
        5.2.6.3 序列同源性分析结果  105-113
    5.4 讨论  113-114
      5.4.1 mRNA 差异显示过程中一些问题的探讨  113-114
        5.4.1.1 RNA 的提取与反转录  113
        5.4.1.2 PCR 扩增条件  113
        5.4.1.3 DDRT-PCR 扩增产物的显示、回收、再扩增  113-114
        5.4.1.4 差异条带的真实性验证  114
    5.5 结论  114-115
  第六章 猪瘟Shimen 株E2基因哺乳动物细胞表达  115-127
    6.1 材料  115-117
      6.1.1 毒株、菌株与表达系统  116
      6.1.2 酶与试剂  116
      6.1.3 各种细胞培养基配制  116-117
        6.1.3.1 细胞培养用试剂  116
        6.1.3.2 细胞消化用试剂  116-117
      6.1.4 主要仪器  117
      6.1.5 引物的设计与合成  117
    6.2 方法  117-120
      6.2.1 Shimen E2 基因的克隆和鉴定  117-118
        6.2.1.1 RNA 的提取  117
        6.2.1.2 反转录合成cDNA  117
        6.2.1.3 PCR 和nPCR  117-118
        6.2.1.4 纯化回收DNA 片段  118
        6.2.1.5 纯化产物与PMD18-T Vector 连接  118
        6.2.1.6 连接产物的转化、涂板、重组质粒的提取  118
        6.2.1.7 重组质粒的鉴定  118
      6.2.2 重组表达载体的构建与鉴定  118-119
      6.2.3 重组真核质粒转染PK-15 细胞及筛选  119
      6.2.4 阳性细胞的免疫组化试验  119
      6.2.5 夹心ELISA 鉴定转染细胞中Shimen 株病毒抗原  119-120
    6.3 结果  120-124
      6.3.1 猪瘟Shimen 株E2 基因的克隆  120
      6.3.2 表达引物PCR 扩增  120-121
      6.3.3 真核表达质粒的构建图  121
      6.3.4 真核表达质粒的PCR 和酶切鉴定  121-122
        6.3.4.1 PEGFP-E2 的核苷酸测序结果  122
        6.3.4.2 PEGFP-E2 的氨基酸序列结果  122
      6.3.5 阳性细胞克隆的PCR 鉴定  122-123
      6.3.6 阳性细胞克隆的荧光鉴定  123
      6.3.7 阳性细胞克隆的免疫组化试验  123-124
      6.3.8 夹心ELISA 鉴定转染细胞中Shimen 株病毒抗原  124
    6.4 讨论  124-126
    6.5 小结  126-127
结论  127-128
参考文献  128-141
致 谢  141-142
作者简介  142

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