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白血病血浆循环DNA完整性和NPM1突变基因定量检测及其临床意义

作　者: 高玉洁
导　师: 张伶
学　校: 重庆医科大学
专　业: 临床检验诊断学
关键词: 急性白血病循环DNA 定量完整性血浆实时荧光PCR定量急性髓系白血病 NPM1基因基因突变
分类号: R733.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的:探讨白血病患者血浆循环DNA的总量和完整性及其临床意义。方法:提取白血病及各对照组血浆样本中的循环DNA,以斑点染色法和实时荧光定量检测血浆循环DNA总量。采用琼脂糖凝胶电泳分析血浆循环DNA片段的完整性;通过实时荧光定量聚合酶链反应扩增不同大小的β-actin (ACTB)片段,以β-actin的长短片段之比(ACTB384/106)来定量检测DNA完整性指标;最后观察了8例急性白血病患者在不同病程中血浆循环DNA完整性指标的动态改变。结果:斑点染色法测定60例急性白血病患者血浆循环DNA总量为(152.4±242)ng/ml,是健康对照者(19.6±7.9)ng/ml的8倍,同时也高于血液系统良性疾病患者以及实体肿瘤患者组。急性白血病血浆循环DNA水平与患者的年龄及病程进展具有显著相关性,而不同型别的急性白血病患者血浆循环DNA含量则未见显著性差异。实时荧光定量检测血浆反映DNA总量的中位数为8.80 ng/ml,显著高于对照组中位数3.42 ng/ml,以此为基础检测白血病患者血浆循环DNA水平的ROC曲线下面积(AUC)为0.79。急性白血病血浆循环DNA电泳呈大小不一的片段,同时血浆循环DNA中可扩增出ACTB的大小片段产物,DNA完整性程度较高。DNA完整性指标的ROC曲线AUC为0.88。8例急性白血病患者的配对样本中DNA完整性指标在完全缓解时有明显减少,而在第一次复发时DNA完整性指标再次升高。结论:急性白血病血浆循环DNA含量和完整性指标明显增高,且与患者的临床特征和病程进展明显相关,可作为新型血浆检验指标用于急性白血病的监测。目的:构建pMDl8-T-NPM1A重组质粒标准品,建立实时荧光定量检测急性髓系白血病(AML)患者血浆NPM1突变基因的方法并探讨其临床意义。方法:提取AML患者外周血浆和血细胞DNA,扩增NPM1A型突变基因(NPM1A)片段,并克隆入T-A载体构建pMDl8-T-NPM1A重组质粒,用PCR和测序鉴定质粒标准品。设计针对NPM1A的引物,探讨最佳反应条件,建立实时荧光定量PCR检测NPM1A的方法,并进行方法学评价(包括灵敏度、特异性、重复性、线性范围)。将本法初步用于临床样本检测,观察AML患者NPM1A水平的改变。结果:成功构建重组质粒pMDl8-T-NPM1A,经PCR和测序鉴定与预期结果一致,符合定量PCR标准品要求。实时荧光定量PCR法的最佳反应条件为:95℃预变性30sec,95℃变性5sec,60℃退火30sec;最适反应体系为:总体积25μl,其中SYBR Premix Ex Taq(2×) 12.5μl、正义、反义引物(10pmol/u1)均为0.5μl,待测标本(临床标本,阳性标准模板,阴性对照和阳性对照)2μl、ddH2O 8μl。该法线性范围较宽(104～1012 copies/m1),灵敏度高(102 copies/m1)、特异性好,重复性好(批内CV值为3.21%;天间CV值为4.87%)。血浆循环DNA中NPM1A的发生与外周血细胞相一致。AML患者血浆NPM1A水平的变化与患者病程进展相关。结论:建立实时荧光定量PCR方法检测血浆NPM1A,方法特异性好、灵敏度高,适用于临床白血病患者血浆样本NPM1A的定量检测。有助于对AML检验的病程检测及预后判断。

全文目录

英汉缩略语名词对照  5-7
中文摘要  7-11
英文摘要  11-15
前言  15-17
第一部分白血病血浆循环DNA 定量和完整性分析  17-29
  1. 材料和方法  17-23
  2. 结果  23-25
  3. 讨论  25-29
第二部分白血病血浆NPM1 突变基因定量检测及其临床意义  29-38
  1. 材料和方法  29-33
  2. 结果  33-35
  3. 讨论  35-38
全文总结  38-39
参考文献  39-42
附图表  42-49
文献综述肿瘤循环核酸的提取检测及临床应用  49-55
致谢  55-56
攻读学位期间发表的学术论文目录  56

白血病血浆循环DNA完整性和NPM1突变基因定量检测及其临床意义

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