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海洋细菌TC-1抗菌活性物质对香蕉枯萎病菌（Foc4）抑制作用的初步研究

作　者: 岳蕾娜
导　师: 易润华
学　校: 广东海洋大学
专　业: 植物病理学
关键词: 海洋枯草芽孢杆菌 香蕉枯萎病菌 抗菌蛋白 脂肽
分类号: S436.68
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 78次
引　用: 1次
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内容摘要


随着陆栖微生物研究的进一步深入,陆栖微生物的筛选及其具有抗菌活性的次生代谢物质的研究也进入一个瓶颈阶段。海洋是人类的资源宝库,海洋微生物所处环境独特,能产生分子结构新颖独特的新型化合物,因此从海洋中筛选微生物资源,开发新的生物活性物质已成世界研究热点,具有重要意义。TC-1菌株是一株分离白海泥的细菌,经鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。本论文研究TC-1菌株产生的无菌发酵液、抗菌蛋白及脂肽类抗生素对香蕉镰刀菌4号小种(Fusarium oxysporum f.sp. cubense (E. F. Smith) Snyder et Hansen Race 4, Foc4)的抑制作用,以及分析了发酵液成分和非蛋白类抗菌活性物质的性质,取得如下结果：1.采用杯碟法和生长速率法,测定TC-1无菌发酵液对Foc4的抑制作用,并对发酵液理化性质及稳定性进行研究。结果表明：TC-1无菌发酵液对Foc4有明显的抑制作用,抑菌圈直径达20.1mm；发酵液抑菌活性随着稀释倍数的增加而降低,50倍发酵液稀释液对Foc4的抑菌率为55.2%,1000倍稀释液对Foc4的抑菌率仅为6.7%。发酵液抑菌活性热稳定性强,100℃下处理60min,抑菌圈直径达19.8mm,与对照比无显著性差异(α=0.05)；发酵液耐酸耐碱,pH2-10范围内,抑菌圈直径13.0-23.3mm；发酵液抑菌活性随着盐浓度的提高而逐渐变小,有盐析现象,不同浓度盐析沉淀抑菌活性呈倒“U”型,以浓度12%、15%沉淀抑菌活性最强,抑菌圈直径均为10.0mmm,上清的抑菌活性随盐浓度提高而逐渐降低；乙酸乙酯抽提物对Foc4的抑制效果最好,抑菌率达58.47%。发酵液对香蕉枯萎病菌1号小种、芝麻枯萎病菌、生菜立枯丝核病菌、白菜立枯丝核病菌、辣椒炭疽病菌、黑曲霉、黑根霉、桉树青枯病菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均有明显的抑制作用,抑菌圈直径分别为22.0mm、15.0mm、23.0mm、16.0mm、25.0mm、21.5mm、14.2mm、25.7mm、16.0mm、20.0mm。2.采用平板对扣试验、发酵液紫外光谱分析法、酸解发酵液氨基酸分析法、GC/MS分析法对TC-1无菌发酵液成分进行研究,结果表明：TC-1菌株产抑制Foc4生长的挥发性抑菌活性物质；发酵液中含有肽类或蛋白抗菌活性物质；发酵液有谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸等17种氨基酸和醇类物质、酸化合物质、卤代物、酯化合物等32种化学成分,其中新生成27种化学成分。3.采用硫酸铵分级盐析法、柱层析法、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法提取、分析发酵液中的抗菌蛋白,并对抗菌蛋白理化性质、稳定性进行研究。结果表明：TC-1抗菌蛋白对Foc4具有明显的抑制作用。用50%-60%饱和度的(NH4)2SO4提取得到抗菌蛋白对Foc4的抑菌活性最强；抗菌蛋白耐高温,120℃处理20min,抑菌圈直径高达20.0mm,与对照相比无显著性差异(a=0.05)；抗菌蛋白酸碱稳定性高,pH2-9范围内对Foc4的抗菌性稳定；对蛋白酶不敏感；对紫外线具有较强的耐受性。经纯化后得到的抗菌蛋白,分子量约50.3KD,对Foc4的抑菌圈直径达16.7mm；对香蕉枯萎病菌1号小种、芝麻枯萎病菌、生菜立枯丝核病菌、白菜立枯丝核病菌、辣椒炭疽病菌、黑曲霉、黑根霉、桉树青枯病菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用,抑菌圈直径分别为22.7mm、18.0mm、31.0mm、28.0mm、30.0mm、27.8mm、20.7mm、28.0mm、23.3mm、10.0mm。4.采用纸层析、薄层色谱法、官能团显色、生物表面活性剂表面活性分析法对可抑菌Foc4生长的有机抽提物进行初步鉴定。乙酸乙酯抽提物经纸层析生物显影,显示对Foc4具有明显的抑制作用,抑菌圈直径达16.3mm; TLC碘显色表明抽提物中含有3个活性物质,其中Rf=0.83处的物质对Foc4具有抑制作用；初步鉴定该物质为脂肽类生物表面活性剂。5.采用酸沉-有机结合法、薄层色谱法、亚甲基蓝-氯仿测定法、LC-MS分析法、生物表面活性评价、杯碟法,测定TC-1脂肽抗生素对Foc4的抑制作用。结果表明：TC-1产生的抑制Foc4生长的抗生素为脂肽类阴离子生物表面活性剂,分子量约1097.3 Da,含量约2.31×10-4mol/L;该脂肽生物表面活性剂的临界胶束浓度(CMC)值为35mg/L,对液体石蜡的油水乳化能力强,对正十六烷-水的排油圈直径为11.6cm；生物表面活性对温度、pH、盐表现出较高耐受性。该脂肽抗生素对Foc4具有极强抑制作用,有效抑菌浓度为0.05g/L,抑菌圈直径为6.5 mm；对温度不敏感,120℃处理60min,抑菌圈直径达23.5 mm；在弱酸、中性及碱性条件下较稳定,酸性条件下抑菌活性降低。该脂肽抗生素对香蕉枯萎病菌1号小种、芝麻枯萎病菌、生菜立枯丝核病菌、白菜立枯丝核病菌、辣椒炭疽病菌、青霉、黑曲霉、黑根霉、酿酒酵母、桉树青枯病菌、大肠杆菌均有明显的抑制作用,抑菌圈直径分别为21.7 mm、14.5 mm、25.0mm、24.0mm、28.3mm、14.8mm、24.8mm、19.0mm、13.8mm、21.0mm、12.0mm。

全文目录


摘要  5-7
Abstract  7-12
1 引言  12-19
  1.1 枯草芽孢杆菌生物防治概况  12-14
    1.1.1 枯草芽孢杆菌抑制多种致病菌  12
    1.1.2 枯草芽孢杆菌主要的抑菌作用机制  12-13
    1.1.3 海洋枯草芽孢杆菌  13
    1.1.4 问题与展望  13-14
  1.2 抗菌活性物质的研究  14-17
    1.2.1 低分子量抗生素  14-17
    1.2.2 高分子量抗菌蛋白的分离纯化  17
  1.3 研究目的和意义  17-19
2 海洋细菌TC-1发酵液对Foc4的抑制作用  19-27
  摘要  19
  2.1 材料与方法  19-21
    2.1.1 供试菌株及来源  19
    2.1.2 试验试剂  19-20
    2.1.3 试验仪器  20
    2.1.4 试验方法  20-21
  2.2 结果与分析  21-25
    2.2.1 发酵液对Foc4的抑制作用  21-22
    2.2.2 温度对发酵液抑菌性的影响  22
    2.2.3 pH对发酵液抑菌性的影响  22-23
    2.2.4 盐对发酵液抑菌性的影响  23-24
    2.2.5 抑菌物质在有机溶剂中的溶解性  24-25
    2.2.6 发酵液对病原菌的抑制作用  25
  2.3 小结与讨论  25-27
3 发酵液成分分析  27-36
  摘要  27
  3.1 材料与方法  27-28
    3.1.1 供试菌株及来源  27
    3.1.2 试验试剂  27
    3.1.3 试验仪器  27
    3.1.4 TC-1菌株产生挥发性抑菌物质的测定  27
    3.1.5 发酵液紫外光谱分析  27
    3.1.6 发酵液氨基酸分析  27-28
    3.1.7 胞外代谢产物的GC/MS分析  28
  3.2 结果与分析  28-35
    3.2.1 TC-1菌株产生挥发性抑菌物质  28
    3.2.2 发酵液紫外光谱分析结果  28-29
    3.2.3 发酵液氨基酸分析结果  29-30
    3.2.4 GC/MS结果分析  30-35
  3.3 小结与讨论  35-36
4 海洋细菌TC-1抗菌蛋白对Foc4的抑制作用  36-46
  摘要  36
  4.1 材料与方法  36-38
    4.1.1 供试菌株及来源  36
    4.1.2 药品与试剂  36
    4.1.3 试验仪器  36
    4.1.4 试验方法  36-38
  4.2 结果与分析  38-45
    4.2.1 抗菌蛋白的粗提取  38-39
    4.2.2 理化因子对抗菌蛋白活性的影响  39-41
    4.2.3 抗菌蛋白的抑菌活性  41-42
    4.2.4 抗菌蛋白的纯化  42-44
    4.2.5 SDS-PAGE分析  44-45
  4.3 小结与讨论  45-46
5 海洋细菌TC-1抑制Foc4的非蛋白抑菌物质的粗提与鉴定  46-53
  摘要  46
  5.1 材料与方法  46-49
    5.1.1 供试菌株及来源  46
    5.1.2 药品与试剂  46
    5.1.3 试验仪器  46
    5.1.4 试验方法  46-49
  5.2 结果与分析  49-51
    5.2.1 抑菌活性物质的结构分析  49-50
    5.2.2 发酵液表面活性分析  50-51
  5.3 小结与讨论  51-53
6 海洋细菌TC-1脂肽抗生素对Foc4的抑制作用  53-66
  摘要  53
  6.1 材料与方法  53-56
    6.1.1 供试菌株及来源  53
    6.1.2 药品与试剂  53
    6.1.3 试验仪器  53
    6.1.4 试验方法  53-56
  6.2 结果与分析  56-64
    6.2.1 生物表面活性剂的分析  56-59
    6.2.2 脂肽生物表面活性剂的评价  59-60
    6.2.3 不同因素对生物表面活性剂溶液性能影响的结果  60-61
    6.2.4 脂肽生物表面活性剂的抑菌研究结果  61-64
  6.3 小结与讨论  64-66
7 全文总结  66-68
  7.1 TC-1产抑制Foc4的挥发性抑菌物质及活性成分分析  66
  7.2 TC-1抗菌蛋白对Foc4的抑制作用  66-67
  7.3 TC-1产生抑制Foc4的脂肽生物表面活性剂  67
  7.4 TC-1脂肽抗生素对Foc4的抑制作用  67-68
参考文献  68-76
致谢  76-77
作者简介  77
导师简介  77

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 园艺作物病虫害及其防治 > 果树病虫害 > 多年生草本果类病虫害
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