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小麦内生枯草芽孢杆菌E1R-j胞外抗菌蛋白的分离纯化和性质研究

作　者: 黄保全
导　师: 黄丽丽
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 植物病理学
关键词: 抗菌蛋白枯草芽孢杆菌小麦全蚀生物防治蛋白酶
分类号: S435.12
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

小麦全蚀病是由禾顶囊壳小麦变种Gaeumannomyces graminis (Sacc.) Arx Oliver var.tritici walker (Ggt)引起的一种危害严重的根部病害,广泛分布于世界各地。由于没有很好的抗病品种和特别有效的化学农药,主要依靠轮作倒茬对其预防和控制,然而轮作倒茬在小麦大面积种植地区存在明显的局限性,因此生物防治成为防治小麦全蚀病一种安全长效而具有开发潜力的措施。内生细菌作为一类新型的微生物资源,已经被人们开始利用来防治植物病害。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis )是一种植物体内常见的内生菌,也是土壤和植物微生态的优势微生物种群,它具有很强的抗逆能力和抑菌防病增产作用,许多性状优良的天然分离菌株已成功地应用于植物病害的生物防治。枯草芽孢杆菌抑菌防病机制包括竞争作用、拮抗作用和诱导植物抗病性。其中,已报道的具有拮抗作用的物质包括抑菌肽类、几丁质酶和葡聚糖酶等抗菌蛋白及次生代谢产生的抗菌素与挥发性抗菌物质。对于生防枯草芽孢杆菌产生的抑菌肽类、几丁质酶、葡聚糖酶及抗生素对病原真菌的拮抗作用,国内外已有较多研究。本实验室首次从小麦根部分离到一株对小麦全蚀菌具有抑制作用的内生枯草芽孢杆菌EIR-j,并对其大田和室内防效做了测验,证明该菌株确实具有开发应用价值。在此基础上,本研究拟从该生防枯草芽孢杆菌胞外代谢产物中分离纯化出对小麦全蚀病菌具有抑制作用的抗菌蛋白,并对该蛋白部分生理生化特征和抗真菌活性进行研究,以确定其抑菌机理。该研究共取得了以下结果:1.对菌株E1R-j胞外抑菌物质进行分离纯化。通过硫酸铵分级沉淀、疏水层析、非变性PAGE和切胶电洗脱、阴离子交换层析从E1R-j无菌发酵滤液中分离纯化得到抗菌蛋白j1。经SDS-PAGE测得j1分子量为51.9kD,经垂直平板等点聚焦电泳测得j1的等电点为8.7。2.对抗菌蛋白j1催化活性的测定结果表明,抗菌蛋白j1不能催化昆布多糖,壳聚糖,羧甲基纤维素等多糖的水解;但以酪蛋白为底物,抗菌蛋白j1表现蛋白酶活性,其相对蛋白酶活为384.67U/mL。3.对抗菌蛋白j1稳定性的测定结果表明,抗菌蛋白j1对蛋白酶K不敏感,具有一定的耐热性(121℃)和紫外线抗性,在pH 5-9范围内表现稳定。4.通过皿内抑菌试验测定了抗菌蛋白j1对5种病原真菌的抑制作用,结果表明,抗菌蛋白j1仅对小麦全蚀菌和苹果轮纹菌有抑制作用。其中,对小麦全蚀菌的抑制中浓度IC50为0.14μg/mL。以上结果可为该菌株及其抗菌蛋白的开发应用提供基础,并为进一步研究其抗菌机理奠定了基础。通过该研究还可以进一步克隆编码该蛋白的基因到寄主植物中,也可以改良该菌株使其更好地在大田防治中发挥防病抑病的效果或者更适合作为生防菌剂进行工业化发酵生产。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-11
第一章文献综述  11-27
  1.1 小麦全蚀病生物防治研究概况  11-12
    1.1.1 小麦全蚀病的分布与危害  11
    1.1.2 小麦全蚀病的生物学特征  11-12
    1.1.3 小麦全蚀病的防治概况  12
  1.2 枯草芽孢杆菌防治植物病害的研究进展  12-15
    1.2.1 枯草芽孢杆菌的生物学特征  12-13
    1.2.2 枯草芽孢杆菌的抑菌机制  13-14
    1.2.3 枯草芽孢杆菌在生物防治中的应用  14-15
  1.3 枯草芽孢杆菌胞外拮抗物质研究进展  15-18
    1.3.1 脂肽类抗生素  15-17
    1.3.2 蛋白类抗菌物质  17-18
  1.4 抗菌蛋白种类和抑菌机理研究进展  18-20
    1.4.1 病原真菌的细胞壁结构  18-19
    1.4.2 抗菌蛋白种类及作用机理研究  19-20
    1.4.3 抗菌蛋白的研究展望  20
  1.5 蛋白质的分离、纯化及鉴定技术  20-25
    1.5.1 蛋白质的粗分离  21
    1.5.2 蛋白质的精细分离  21-23
    1.5.3 蛋白质的鉴定  23-25
  1.6 本究的目的和意义  25-27
第二章材料与方法  27-31
  2.1 材料  27
    2.1.1 供试菌株  27
    2.1.2 培养基  27
    2.1.3 试剂与仪器  27
  2.2 方法  27-31
    2.2.1 硫酸铵分级沉淀及粗蛋白制备  27
    2.2.2 抗菌蛋白抑菌活性检测  27-28
    2.2.3 蛋白脱盐浓缩，浓度测定与保存  28
    2.2.4 抗菌蛋白的纯化方法  28-29
    2.2.5 抗菌蛋白的非变性电泳检测  29
    2.2.6 抗菌蛋白j1 分子量的测定  29
    2.2.7 抗菌蛋白j1 等电点的测定  29
    2.2.8 抗菌蛋白j1 的环境稳定性  29-30
    2.2.9 抗菌蛋白j1 的催化活性  30-31
第三章结果与分析  31-42
  3.1 硫酸铵分级沉淀和粗蛋白制备  31-32
  3.2 粗蛋白的 PAGE 和切胶电洗脱回收  32-33
  3.3 抗菌蛋白的分离纯化  33-34
  3.4 抗菌蛋白的分子量和等电点  34-36
  3.5 抗菌蛋白的浓度测定和回收率计算  36-37
  3.6 抗菌蛋白的皿内抑菌试验  37-38
  3.7 抗菌蛋白的稳定性  38-39
  3.8 抗菌蛋白的催化活性  39-42
第四章结论与讨论  42-45
  4.1 结论  42
  4.2 讨论  42-44
  4.3 下一步工作计划  44-45
参考文献  45-52
致谢  52-53
个人简介  53

小麦内生枯草芽孢杆菌E1R-j胞外抗菌蛋白的分离纯化和性质研究

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