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菠萝蜜SSR分子标记的开发及其在种质资源遗传多样性分析中的应用

作　者: 王艳红
导　师: 叶春海
学　校: 广东海洋大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 菠萝蜜(Artocarpus heterophyllus Lam.) 分子标记开发 SSR 遗传多样性
分类号: S667.8
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

要想从更深层次上发掘和利用现有的菠萝蜜(Artocarpus heterophyllus Lam.)种质,必须找到一个强有力的进行菠萝蜜种质分析的工具。为此,本文进行了菠萝蜜SSR(简单重复序列DNA,simple sequence repeat DNA)标记的开发研究,以期为菠萝蜜种质资源研究提供一个强有力的、高效的分析手段。本研究分为两个部分:菠萝蜜叶绿体SSR(cpSSR)引物的开发及遗传多样性的分析和核基因组SSR(nSSR)引物的开发及遗传多样性的分析。叶绿体SSR的开发是利用现有的、其他植物上的叶绿体SSR引物,筛选其在菠萝蜜上的可扩增性,并用之研究菠萝蜜种质的遗传多样性。基因组SSR引物的开发将菠萝蜜基因组DNA经酶切后转变成AFLP DNA片段,然后用生物素标记的简单重复序列(SSR)作探针与其杂交,杂交复合物固定到包被有链霉亲和素的磁珠上,经过一系列的洗涤过程,含有SSR的AFLP片段被吸附在磁珠表面。这些片段经洗脱下来后,克隆测序,得到SSR位点序列。根据位点序列,设计SSR分子标记用引物,筛选、优化后用于遗传多样性分析。主要研究结果如下:1.试验得出菠萝蜜cpSSR的最佳反应体系为:在20μL反应体系中DNA模板量为2.5 ng/μl,Taq DNA聚合酶为1 U,引物浓度为0.2μmol/L,dNTPs的浓度为0.2 mmol/L,Mg2 +浓度为1.5 mmol/L,10×PCR缓冲液2.0μl。PCR扩增反应程序是:94℃预变性4 min;94℃变性1 min,退火50 s(退火温度因引物而定),72℃延伸1 min,35个循环;72℃延伸10 min。2.从23条cpSSR引物中筛选出了效果较好的9条引物用于菠萝蜜cpSSR分析。在用于cpSSR分析的24份种质中,每条cpSSR引物均扩增出一条带,种质资源间无多态性。3.在菠萝蜜核基因组SSR引物开发中,共挑取83个克隆用于测序,其中有4个相同序列,共得到79个序列。在这79个序列中,有88.6%(70/79)含有一种以上微卫星类型。以2个以上碱基为重复单位,重复数为3以上的微卫星序列占39.2%(31/79)。4.成功测序的83个微卫星序列中,有31个有效位点,除一些微卫星序列因本身结构或两端太短不能设计引物外,共设计引物19对。5.菠萝蜜核基因组SSR分子标记的最佳反应体系为:在20μL反应体系中DNA模板量为2 ng/μL,Taq DNA聚合酶为1 U,引物浓度为0.2μmol/L,dNTPs的浓度为0.2 mmol/L,Mg2 +浓度为2 mmol/L,10×PCR缓冲液2.0μL。PCR扩增反应程序是:94℃预变性4 min;94℃变性1 min,退火50 s(退火温度因引物而定),72℃延伸1 min,35个循环;72℃延伸10 min。6.在用于核基因组SSR分子标记分析的68份种质中,19条SSR引物共扩增出50条带,其中多态性条带数44条,多态性位点百分率88%;扩增条带最多的引物为JSR6,扩增出5条。7. 44个扩增位点的平均PIC(多态信息含量,polymorphism information content)为0.24,其中PIC值为0.40~0.50的位点和0.00~0.10的位点最多,为13个,各占29.55%;而PIC为0.10~0.20的位点最少,为4个,占0.09%;引物JSR17的平均PIC值最高,为0.4341;平均PIC值最低的为0.0938。8.各种质之间的遗传相似系数在0.5763~0.9655之间,平均相似性系数为0.8140。9.根据核基因组SSR扩增结果进行UPGMA聚类显示,所研究种质明显的分为两类。第一类包括来自海南、云南和部分雷州半岛的种质,第二类包括来自巴基斯坦、尖蜜拉和剩余的雷州半岛的种质。初步结果表明,核基因组SSR分子标记可将海南、云南的种质与巴基斯坦的种质分开,但还不能区分来自马来西亚的种质,也不能区分干、湿包种质。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-12
1 引言  12-13
2 文献综述  13-24
  2.1 SSR 分子标记在植物种质资源研究中的应用  13-16
    2.1.1 cpSSR 在植物种质资源研究中的应用  13-14
    2.1.2 nSSR 分子标记在果树遗传育种中的应用  14-16
  2.2 菠萝蜜种质资源研究进展  16-18
    2.2.1 形态性状  16-17
    2.2.2 分子标记  17-18
    2.2.3 生化标记  18
  2.3 SSR 分子标记的开发技术  18-24
    2.3.1 nSSR 引物的开发  18-22
    2.3.2 cpSSR 引物的开发  22-24
3 材料与方法  24-35
  3.1 材料  24-26
    3.1.1 菠萝蜜种质材料  24-25
    3.1.2 主要仪器与试剂  25-26
  3.2 方法  26-35
    3.2.1 DNA 的提取  26
    3.2.2 DNA 质量的检测及酶切  26-27
    3.2.3 SSR 序列富集  27-28
    3.2.4 大肠杆菌感受态的制备  28-29
    3.2.5 引物设计  29-30
    3.2.6 反应体系优化  30
    3.2.7 nSSR 分子标记扩增产物的银染与检测  30-31
    3.2.8 cpSSR 引物筛选及体系优化  31
    3.2.9 cpSSR 扩增产物银染与检测  31-33
    3.2.10 遗传多样性分析  33-35
4 结果与分析  35-45
  4.1 DNA 纯度分析  35
  4.2 磁珠法富集菠萝蜜SSR 序列  35-36
  4.3 微卫星序列分析  36-37
  4.4 菠萝蜜SSR 引物设计  37-38
  4.5 SSR 反应体系优化与引物筛选  38-39
    4.5.1 SSR 反应体系的优化和建立  38
    4.5.2 引物筛选和退火温度的确定  38-39
  4.6 基于SSR 种质资源遗传多样性的数据分析  39-44
    4.6.1 引物扩增多态性分析  40-41
    4.6.2 遗传多样性分析  41-42
    4.6.3 聚类分析  42-44
  4.7 基于 cpSSR 种质资源遗传多样性的数据分析  44-45
5 讨论  45-48
  5.1 磁珠富集法开发菠萝蜜微卫星标记  45
  5.2 菠萝蜜微卫星序列探讨  45
  5.3 不同遗传分子标记对菠萝蜜遗传多样性分析结果的差异比较  45-46
  5.4 菠萝蜜种质的遗传多样性  46
  5.5 干包和湿包种质间的差异比较  46-47
  5.6 cpSSR 扩增结果的探讨  47-48
参考文献  48-54
致谢  54-55
附录  55-61
作者简介  61-62
导师简介  62

菠萝蜜SSR分子标记的开发及其在种质资源遗传多样性分析中的应用

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