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猪SRPK1及SRPK3基因的克隆、表达及多态性研究

作　者: 俄广鑫
导　师: 刘娣
学　校: 东北农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 猪精氨酸/丝氨酸蛋白激酶基因实时定量PCR 反向PCR 骨骼肌损伤
分类号: S828
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

精氨酸-丝氨酸蛋白激酶(SRPK)基因是SR蛋白特异磷酸化激酶基因家族成员之一。其中SRPK1被定位于一段控制脂肪性状的QTL区域,而SRPK3的过量和减少表达都会导致肌卫星细胞出现病变或导致生物个体死亡。因此,应用现代分子生物学技术研究猪SRPK1、SRPK3基因的分子遗传结构和作用模式,对研究猪肉质性状有十分重要的理论意义,并为分子标记辅助选择和转基因猪打下基础。本研究以大白猪为研究对象,克隆了大白猪SRPK1基因和SRPK3基因,对其结构和功能及分子进化进行了分析,并对1日龄和30日龄的大白猪和杜洛克猪的心、肝、脾、胃、肾、肺、大肠、小肠、脑、肌肉的表达情况进行了比较分析。检测了SRPK1和SRPK3基因部分外显子的多态性；构建了猪骨骼肌损伤模型,检测SRPK1、SRPK3在骨骼肌损伤修复过程中的表达情况,并通过该模型研究SRPK1、SRPK3、MyoD、FoxOI、MEF2A、MEF2B和MEF2D基因的相关性。主要研究结果如下：(1)利用RT-PCR和I-PCR技术克隆了SRPK1基因的mRNA序列2499bp其中包括1968bp完整的CDS区域和325bp的5’UTR序列,编码656个氨基酸；获得SRPK3基因的1708bp核苷酸片段涵盖SRPK3的全长CDS区域,共编码567氨基酸。(2)利用生物信息学方法分析SRPK1、SRPK3基因核酸序列及编码蛋白序列的结构特点发现各自都包括1个P Kc和1个ATP-binding结构域,猪SRPK1蛋白序列与人和黑猩猩的相似性较高。SRPK1的5’UTR含有多种转录结合位点：HSF1, HSF2, Ik-1, IK-2, SRY, SP1 MyoD, USF, E47, p300, CP2, RREB-1, E2F, AP-1。猪SRPK1及SRPK3蛋白序列与人和牛的相似性较高。(3)利用PCR-SSCP技术对大白猪、民猪、野家杂交猪的SRPK1基因的第8、10、11、16外显子和SRPK3的第6、9外显子进行了多态性检验。结果显示SRPK1所检测的外显子区域无多态性,SRPK3的第6外显子上有A629→G629,T653→T653的突变,氨基酸变化为Pro→His, Ile→Thr;第9外显子处的G1059→A1059,氨基酸无突变。(4)猪SRPK1和SRPK3基因表达都具有组织和品种间特异性,SRPK1主要在消化器官处表达而SRPK3基因主要在肌肉和心肌内表达。(5)SRPK1基因在骨骼肌损伤修复过程中出现升高和降低反复交替的现象,SRPK3的表达持续升高。(6)检测了包括MyoD、MEF2A在内的其他几个成肌因子的骨骼肌上修复过程中的表达情况,并分析了它们之间的相关性,结果显示仅SRPK1与SRPK3相关极显著(p<0.01),SRPK1与MEF2D相关显著(p<0.05),其他各组都不显著(p>0.05)。

全文目录

中文摘要  8-9
英文摘要  9-11
1 引言  11-26
  1.1 骨骼肌的发生和发育  11-13
    1.1.1 骨骼肌的发生过程  11
    1.1.2 骨骼肌发育过程  11-12
    1.1.3 骨骼肌发生和发育过程中的调控因子  12-13
  1.2 SR激酶  13-18
    1.2.1 RNA剪接和细胞周期调控的联系因子  13-14
    1.2.2 磷酸化SR蛋白的其他激酶  14-15
    1.2.3 SRPK研究进展  15-16
    1.2.4 选择性剪接作用原理及作用因子的研究进展  16-18
  1.3 骨骼肌损伤  18-24
    1.3.1 骨骼肌损伤的实验动物模型  19-20
    1.3.2 EIMD变化阶段  20-21
    1.3.3 肌卫星细胞激活与成肌分化的调控  21-22
    1.3.4 骨骼肌损伤后的炎症反应及修复  22-24
  1.4 本研究的目的和意义  24-26
2 材料与方法  26-42
  2.1 实验材料  26-28
    2.1.1 实验动物  26
    2.1.2 菌株和克隆载体  26
    2.1.3 主要仪器设备  26-27
    2.1.4 主要药品和酶  27
    2.1.5 缓冲液及主要溶液的配制  27-28
    2.1.6 工具酶及试剂盒  28
  2.2 实验方法  28-42
    2.2.1 耳组织样DNA的提取  28-29
    2.2.2 组织样总RNA的提取与检测  29-30
    2.2.3 引物设计与合成  30-32
    2.2.4 大白猪SRPK1、SRPK3基因克隆  32-36
    2.2.5 PCR-SSCP检测  36-38
    2.2.6 基因多态性的统计方法  38-39
    2.2.7 Real Time PCR反应  39
    2.2.8 石蜡切片及HE染色  39-40
    2.2.9 主要分子生物学软件及统计分析软件  40-42
3 结果与分析  42-67
  3.1 大白猪SRPK1、SRPK3基因的克隆  42-44
    3.1.1 猪SRPK1基因CDS区及部分5'UTR序列克隆测序  42
    3.1.2 反向克隆SRPK1部分5'UTR  42-43
    3.1.3 猪SRPK3基因CDS区克隆  43-44
  3.2 猪SRPK1、SRPK3序列结构分析  44-51
    3.2.1 猪SRPK1、SRPK3一级结构分析  44-45
    3.2.2 猪SRPK1、SRPK3二级结构分析  45-47
    3.2.3 猪SRPK1、SRPK3的功能结构域分析  47-48
    3.2.4 猪SRPK1、SRPK3基因分子进化分析  48-50
    3.2.5 SRPK1转录结合位点预测  50-51
  3.3 PCR-SSCP分析结果  51-53
  3.4 组织表达谱构建  53-58
    3.4.1 扩增曲线和溶解曲线的绘制  53-55
    3.4.2 定量分析  55-58
  3.5 骨骼肌损伤及肌分化过程中SRPK1、SRPK3的表达  58-60
    3.5.1 病理症状  58
    3.5.2 病理性结果  58-60
  3.6 构建骨骼肌修复发育过程中SRPK1、SRPK3与骨骼发育相关因子相关性分析  60-67
    3.6.1 MyoD、FoxOI、MEF2A、MEF2B、MEF2D在骨骼肌损伤修复过程中的表达情况  60-65
    3.6.2 成肌因子相关性分析  65-67
4 讨论  67-72
  4.1 SRPK1、SRPK3基因的克隆与生物信息学分析  67
  4.2 SRPK1、SRPK3基因的多态性分析  67-69
  4.3 猪的SRPK1、SRPK3基因的组织表达特性分析  69
  4.4 猪的SRPK1、SRPK3基因在骨骼肌损伤修复的表达  69-70
  4.5 骨骼肌发育相关因子相关性分析  70-72
5 结论  72-73
致谢  73-74
参考文献  74-80
附录  80-85
攻读硕士学位期间发表的学术论文  85

猪SRPK1及SRPK3基因的克隆、表达及多态性研究

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