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斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）C-反应蛋白基因的克隆、表达及多克隆抗体制备

作　者: 邓传燕
导　师: 吴灶和；简纪常
学　校: 广东海洋大学
专　业: 水产养殖
关键词: C-反应蛋白亲和层析多克隆抗体荧光定量克隆表达
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

本研究利用已构建的斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)头肾Smart cDNA文库,首次克隆表达了斜带石斑鱼C-反应蛋白(EC-CRP)基因,并纯化获得了EC-CRP基因表达蛋白。EC-CRP的cDNA全长为946bp,其中5′非翻译区(5′-UTR)为148bp,3′非翻译区(3′-UTR)为123 bp,开放阅读框(ORF)为675bp,编码225aa。序列同源性分析发现,其氨基酸序列与大西洋鲑(Salmo salar)同源性最高,为42.58%。重组表达蛋白主要以包涵体形式存在,经亲和层析纯化获得带His标签的EC-CRP表达蛋白,SDS-PAGE电泳表明其分子量为25kDa。斜带石斑鱼CRP表达蛋白的获得为其疾病诊断和相关分子机理研究奠定了基础。Real-time PCR法研究溶藻弧菌免疫斜带石斑鱼后CRP基因在不同组织里的表达水平差异,结果发现,溶藻弧菌免疫斜带石斑鱼24h后CRP在斜带石斑鱼的头肾、脾脏、肝脏、肾脏、小肠、心脏、鳃、胸腺组织中均有表达,其中头肾中表达量最高,肝脏次之,然后依次是肾脏、脾脏、肠、心脏、和腮,胸腺中表达量最少。随着斜带石斑鱼感染时间的增长,CRP表达量在各组织达到峰值的时间不同:3h时鳃组织中表达量达峰值,为正常值的1.5倍;6h时胸腺组织中表达量达峰值,为正常值的2倍;12h时脾脏和肾脏组织中表达量达峰值,都为正常值的5倍;24h时头肾和肠组织中表达量达峰值,为正常表达量的50倍和1.5倍;48h时肝脏组织到达到峰值,为正常值的20倍。斜带石斑鱼在分别含10ppm苯酚、20ppm CdCl2和2ppm CuSO4的海水中暴露,以头肾组织为模式组织,发现随着时间的增加CRP表达量逐渐增加,分别在6h、6h、6h及12h处最高,分别为正常表达量的50倍、30倍和15倍。这些现象说明了鱼机体内对不同污染胁迫解毒紧迫性的必要程度可能有所差别。由于CRP的表达水平与暴露时间和污染物的性质有较好的关联性,而且随着暴露时间的延长与CRP浓度变化的趋势具有一致性,因此提示可以作为污染早期效应生物标志物。采用了溴化氰活化的Sepharose4B作为亲和吸附剂基质,选用phosphorylcholine chloride calcium作为配体,制得了纯化CRP的PC-Sepharose亲和层析柱,提取到了的CRP天然蛋白纯品。SDS-PAGE分析发现,该蛋白只含有一种亚基,大小约为26kDa,表明斜带石斑鱼和其他绝大部分鱼类一样,CRP中只含有一类亚基。本研究制备了兔抗CRP天然蛋白血清和兔抗CRP表达蛋白血清,发现前者能与斜带石斑鱼的血清发生抗原抗体反应,不能与CRP表达蛋白以及红笛鲷的血清发生抗原抗体反应;后者不能与CRP天然蛋白及斜带石斑鱼的血清发生抗原抗体反应,该抗体的制备为进一步研究C-反应蛋白的性质和功能奠定了基础。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-13
1 前言  13-27
  1.1 C-反应蛋白研究进展  13-17
    1.1.1 C-反应蛋白简介  13
    1.1.2 C-反应蛋白的结构和功能  13-14
    1.1.3 C-反应蛋白在医学上的应用  14-15
    1.1.4 C-反应蛋白的检测  15-16
    1.1.5 C-反应蛋白的检测在水产养殖方面的研究进展  16-17
  1.2 鱼类的非特异性免疫系统  17-19
    1.2.1 鱼类的体液免疫  17
    1.2.2 鱼类的溶菌酶  17-18
    1.2.3 鱼类的补体  18
    1.2.4 鱼类的其他体液免疫  18-19
  1.3 鱼类的免疫器官和组织  19-20
  1.4 实时荧光定量PCR  20-24
    1.4.1 实时荧光定量PCR 检测技术原理  20-23
    1.4.2 实时荧光定量PCR 技术的两种定量形式  23-24
  1.5 固相亲和层析  24-25
    1.5.1 载体的选择  24-25
    1.5.2 配基的选择  25
  1.6 本研究的目的意义  25-27
2 斜带石斑鱼-反应蛋白基因的克隆表达及序列分析  27-48
  2.1 实验材料  27-31
    2.1.1 斜带石斑鱼  27
    2.1.2 载体与菌株  27
    2.1.3 主要试剂  27
    2.1.4 所用溶液配制  27-31
    2.1.5 实验仪器  31
  2.2 实验方法  31-38
    2.2.1 斜带石斑鱼头肾组织总RNA 的提取  31-32
    2.2.2 第一链cDNA 的合成（M-MLV Reverse Transcriptase，Takara）  32
    2.2.3 斜带石斑鱼CRP 基因(EC-CRP)的序列分析和原核表达  32
    2.2.4 斜带石斑鱼CRP 基因(EC-CRP)的原核表达  32-33
    2.2.5 琼脂糖凝胶电泳  33-34
    2.2.6 回收PCR 产物目的片段  34
    2.2.7 构建重组质粒  34-35
    2.2.8 重组表达质粒的构建  35-36
    2.2.9 基因工程重组表达菌株的诱导表达  36-38
  2.3 结果  38-46
    2.3.1 斜带石斑鱼总RNA 的提取，cDNA 的反转录  38-39
    2.3.2 CRP 基因序列分析  39-42
    2.3.3 CRP 基因的扩增  42-44
    2.3.4 CRP 重组质粒的构建  44
    2.3.5 CRP 重组质粒的表达  44-45
    2.3.6 不同温度下融合蛋白表达形式（包涵体或可溶性表达）的分析  45-46
    2.3.7 CRP-his 融合蛋白的纯化  46
  2.4 讨论  46-48
3 斜带石斑鱼CRP 基因的差异表达  48-57
  3.1 实验材料  48-49
    3.1.1 斜带石斑鱼及处理  48
    3.1.2 主要试剂及溶液配制  48
    3.1.3 主要仪器  48-49
  3.2 实验方法  49-50
    3.2.1 斜带石斑鱼各组织总RNA 的提取  49
    3.2.2 第一链cDNA 的合成（M-MLV Reverse Transcriptase，Takara）  49
    3.2.3 引物的设计  49-50
    3.2.4 实时定量PCR（双内参法）  50
  3.3 结果  50-54
    3.3.1 溶藻弧菌免疫斜带石斑鱼24h 后CRP 各组织表达差异  50-51
    3.3.2 溶藻弧菌免疫斜带石斑鱼后各组织CRP 时间表达差异  51-52
    3.3.3 10ppm 苯酚处理斜带石斑鱼后CRP 时间表达差异  52-53
    3.3.4 20ppm CdCl_2 处理斜带石斑鱼后CRP 时间表达差异  53
    3.3.5 2ppm CuSO_4 处理斜带石斑鱼后CRP 时间表达差异  53-54
  3.4 讨论  54-57
4 斜带石斑鱼血清中CRP 的提取  57-63
  4.1 实验材料  57-58
    4.1.1 斜带石斑鱼  57
    4.1.2 主要试剂及溶液的配制  57
    4.1.3 实验仪器  57-58
  4.2 实验方法  58-59
    4.2.1 配基（PC）与凝胶的偶联  58
    4.2.2 装柱  58
    4.2.3 斜带石斑鱼血清样品的制备  58
    4.2.4 亲和层析法提取斜带石斑鱼血清中的CRP  58-59
    4.2.5 测定CRP 天然蛋白溶液中CRP 的含量  59
    4.2.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析CRP 融合蛋白与天然蛋白  59
  4.3 结果  59-61
    4.3.1 PC-Sepharose 亲和层析柱  59-60
    4.3.2 Bradford 法蛋白定量标准曲线  60-61
    4.3.3 CRP 天然蛋白的提取  61
  4.4 讨论  61-63
5 兔抗斜带石斑鱼CRP 血清的制备  63-72
  5.1 实验材料  63-64
    5.1.1 实验动物  63
    5.1.2 主要试剂  63
    5.1.3 所用试剂和溶液的配制  63-64
    5.1.4 实验仪器  64
  5.2 实验方法  64-66
    5.2.1 抗原的准备  64
    5.2.2 取对照血清  64-65
    5.2.3 兔抗 CRP 的制备  65
    5.2.4 多克隆抗体的鉴定  65-66
  5.3 结果  66-70
    5.3.1 CRP 天然蛋白与兔抗CRP 天然蛋白血清琼脂双向扩散反应  66-67
    5.3.2 兔抗CRP 天然蛋白血清与斜带石斑鱼血清琼脂双向扩散反应  67
    5.3.3 CRP 表达蛋白与兔抗CRP 表达蛋白血清琼脂双向扩散反应  67-68
    5.3.4 CRP 表达蛋白与兔抗CRP 天然蛋白血清琼脂双向扩散反应  68-69
    5.3.5 三种抗原与兔抗CRP 表达蛋白血清琼脂双向扩散反应  69-70
    5.3.6 红笛鲷血清与兔抗CRP 天然蛋白血清琼脂双向扩散反应  70
    5.3.7 ELISA 法测抗体效价  70
  5.4 讨论  70-72
6 结论  72-73
参考文献  73-79
致谢  79-80
作者简历  80-81
导师简介  81

斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）C-反应蛋白基因的克隆、表达及多克隆抗体制备

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